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怎么筛选斑马鱼crispr产生的突变体
怎么筛选斑马鱼crispr产生的突变体
337:816-21。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多：CRISPR/Cas9加速基因挖掘，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science？由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。将 CRISPR&#47，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，将其直接转染入细胞十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用。CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）；Science，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本。“目前, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链，这种分子能通过互补结合靶标，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。如何 CRISPR 我的靶标，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。当微生物感染了这些病毒中的一种。近期，Doudna 研究组利用这种工具，但未在灵长类动物中完成过（详细报道 Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。在这一方面，比如目的基因中的 DNA 片段;Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，分析细胞中，也就是 Cas，它能与 Cas 形成复合物，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，这种酶来自于一种链球菌。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，包括人类细胞，小鼠，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。近期《科学家》（The Scient......
怎么筛选斑马鱼crispr产生的突变体 ……
十年前,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候,他们并没有预料到这会给基...CRISPR 到底是一种怎样的技术？ - 知乎973被浏览82732分享邀请回答11126 条评论分享收藏感谢收起23331 条评论分享收藏感谢收起查看更多回答3 个回答被折叠（）　　CRISPR基因组编辑是目前大热的新技术，它利用短RNA（gRNA）来引导核酸酶（Cas9）到达DNA靶点。与之前的基因组编辑方法（ZFN和TALEN）相比，这种新方法具有快速、高效、廉价且易于操作等优点，因而被快速采用。眼看着CRISPR频频出现在各大期刊上，也许你也想尝试一下这种新技术。在此，我们就介绍一下CRISPR实验的一些主要步骤，以及需要考虑的因素。
1. 选择一个CRISPR系统
首先，你要考虑一下为什么要使用CRISPR系统，是破坏感兴趣的基因，还是编辑或修饰内源的基因组？这需要通过不同的修复途径来实现。
破坏感兴趣的基因
Cas9核酸酶有两个功能结构域：RuvC和HNH，每个切割一条不同的DNA链。当这两个结构域激活时，Cas9在基因组DNA上产生双链断链（DSB）。在缺乏适当的修复模板时，DSB通过非同源末端连接（NHEJ）途径来修复。在NHEJ修复过程中，DSB位点会随机插入或删除几个核苷酸，这可能带来插入缺失（InDel）。InDel改变目的基因的开放阅读框（ORF），可能明显改变DSB下游的氨基酸序列。此外，InDel可能引入提前终止密码子。这种修复的结果就是目的基因被破坏。不过需要注意的是，NHEJ引入的InDel是随机的，因此需要通过实验来确定基因破坏的类型和程度。
编辑/修饰内源基因组
CRISPR系统也能在目标序列上引入特定的核苷酸修饰，这就要依靠另一种修复机制：同源指导修复（HDR）。在HDR修复过程中，必须存在一条包含所需序列的DNA修复模板。DNA模板通常与gRNA/Cas9一起转染到细胞中，并且必须与DSB上下游的序列有着很高的同源性。当合适的模板存在时，HDR能在Cas9诱导的DSB上引入特定的核苷酸修饰。同样，这个修饰也必须通过实验来证实。
目前有多个厂家提供CRISPR质粒，包括Life Technologies、Sigma-Aldrich等。他们大多提供all-in-one的系统，既表达Cas9核酸酶，又表达gRNA，这样很方便。具体可看我们之前的系列文章：CRISPR新品巡礼。
此外，许多科学家也对CRISPR/Cas系统的一些元件进行了改造，以增强系统的特异性或实现某些特定的功能。如果你需要这样的一些质粒，可以去Addgene网站上查找（）。同时，它也收录了一些知名的实验室设计的质粒。Addgene是一个非营利性组织，主要是为了减少研究人员索取质粒的繁琐过程，但它会收取一定的手续费和运费。
Addgene目前在中国的经销商是北京中原公司。这也就是说，你在网站上找到了感兴趣的质粒，可以通过电话（400--10-）或电子邮箱 () 的方式向北京中原公司下订单。
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联系信箱：CRISPR/Cas系统最新研究进展
CRISPR/Cas系统最新研究进展
CRISPR/Cas系统最新研究进展
The Latest Research Progress on CRISPR/Cas System
收稿日期：
CRISPR/Cas系统最新研究进展[J]. 生物技术通报, ): 53-58
CHEN Hang.
The Latest Research Progress on CRISPR/Cas System[J]. Biotechnology Bulletin, ): 53-58
CRISPR/Cas系统最新研究进展
中国林业科学研究院资源昆虫研究所，昆明 650224;
国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，昆明 650224
基金项目： 国家林业局948项目（），云南省科技计划面上项目（）
作者简介：
刘妮，女，硕士研究生，研究方向：资源昆虫分子生态与进化；E-mail：
通讯作者：
陈航，男，博士，副研究员，研究方向：资源昆虫生物化学与分子生物学；E-mail：
摘要：CRISPR/Cas系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统。作为一种新型的基因组编辑技术，具有设计简单、特异性强、效率高等优点，为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命。就CRISPR/Cas系统的研究背景、存在类型以及TypeⅡ和TypeⅢ CRISPR系统的基本作用原理和新的研究突破做了较为详尽的介绍，以便为读者和相关领域的研究者提供参考。
基因组编辑技术&&&&
CRISPR/Cas系统&&&&
The Latest Research Progress on CRISPR/Cas System
The Research Institute of Resources Insects, the Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224;
Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects, State Forestry Administration, Kunming 650224
Abstract: The CRISPR/Cas is a system of immune mechanism for bacteria and archaea against exogenous virus and plasmid DNA invasion. As a novel genome editing technology, it possesses the advantages of a simple design, strong specificity, and high efficiency, bringing revolutionary breakthrough for genome directional modification, regulation and application. We introduce the research background, the existence type of the CRISPR/Cas system, and basic action mechanism of Type Ⅱ and Type Ⅲ CRISPR system and new research breakthrough in detailed, for providing the reference for readers and researchers in related fields.
Key words:
genome editing technology&&&&
CRISPR/Cas system&&&&
基因组编辑是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主要是进行DNA序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究[]。基因组编辑技术日益成为生物学研究的热点，目前基因组编辑技术主要包括巨核酶技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应因子核酸酶技术及CRISPR相关核酸酶技术[]。它们在基因工程中已经得到了诸多成功的应用，然而上述传统的基因组编辑技术存在明显的不足。例如，锌指核酸梅（zinc-finger nucleases，ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸梅（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）核酸酶技术原理几乎是一样的，而一个新的ZFN和TALEN嵌合蛋白均需改造才能识别靶序列，这就使得两种基因组编辑技术的广泛推广应用受阻，但CRISPR相关核酸酶技术只需要一小段引导RNA（guide RNA、gRNA）就能识别特定的DNA[]，且一个新的位点只需要一个新的gRNA，极大的简化了基因组编辑的过程，扩大靶位点的选择，具有更大的潜力。CRISPR系统也可以应用于靶向基因突变和基因修正，可以实现大片段DNA的缺失以及复合基因编辑。
本文将针对CRISPR/Cas系统的结构、分类、原理以及目前具有突破性研究并迅速发展的TypeⅡ CRISPR/Cas系统和TypeⅢ CRISPR/Cas系统的突破性研究做较为详尽的综述。
CRISPR/Cas的基因座结构
CRISPR/Cas的基因座结构相对简单（），对于一个有效的CRISPR/Cas系统而言，通常包含两个部分：第一部分是位于基因组中正向重复序列和来源于外源DNA的间隔序列组成3'端CRISPR基因座，对于重复序列而言在长度和序列上几乎一致，在不同的物种之间长度范围在21-47 bp，平均在32 bp[, ]；间隔序列在长度上是一致的，长度范围在20-72 bp，但在序列上表现出多样性[, ]。亲缘关系相近的物种具有相似的重复序列，但是在全部的细菌和古细菌序列中间隔序列和重复序列都表现出极大的差异[]。第二部分是位于CRISPR基因座5'端成簇的Cas基因，主要包括一些核酸酶、解旋酶、聚合酶和RNA结合蛋白等，主要参与CRISPR/Cas系统介导的免疫过程[]。
图 1 CRISPR/Cas基因座结构
CRISPR的分布与分类
目前对于CRISPR/Cas系统而言主要分为3种类型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ三种不同类型[]，从另一方面也反映出在自然界中CRISPR/Cas系统具有多态性。
TypeⅠCRISPR/Cas系统在细菌和古细菌中被发现，包含6种不同的Cas蛋白，其中在干涉反应中最重要和最显著的是Cas3蛋白，它包含一个HD磷酸化水解酶结构域和一个类DExH解旋酶结构域，这两个结构域在ATP和Mg2+存在的情况下能够解开dsDNA（解旋酶结构域）和切割ssDNA（HD核酸结构域）[]。
TypeⅡ CRISPR/Cas系统仅仅在细菌的基因组中发现[]，其中Cas9是分子量很大的多功能蛋白，参与crRNAs的成熟和随后的干涉反应[]。Cas9蛋白包含有两个亚基，在Mg2+存在条件下，其中McrA/HNH切割与crRNA互补的DNA链，而类RuvC切割非互补链[]。
Type Ⅲ CRISPR/Cas系统主要在古细菌中发现，包括type Ⅲ-A和type Ⅲ-B两种类型，两者的差别主要是A型干扰的靶标是mRNA，B型干扰的靶标是DNA[]，其中type Ⅲ-B系统与其他1或2种CRISPR亚单位相结合[]。
type Ⅲ-B系统特征性蛋白是Cas10蛋白，而Cas10蛋白具有RNA活性参与crRNA的成熟和剪切入侵外源DNA[, ]。
最近几年，CRISPR/Cas技术因其相对较为简单，而得到较为迅速的发展，如在作物育种、基因治疗以及动物建模等领域都已得到广泛的应用[]。随着测序技术的不断发展，越来越多的细菌和古细菌的基因组信息被解密，为后续CRISPR/Cas系统的改造和应用提供更加有力的指导。
CRISPR/Cas作用机制
TypeⅡ CRISPR/Cas系统基本原理
一个简易的TypeⅡ CRISPR/Cas系统必定要含有Cas9和gRNA，Cas9核酸酶具有改造crRNA和破坏双链DNA的双重功能[]，位于gRNA 5'端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决定CRISPR/Cas9系统的特异性。
基本原理（）：首先，Cas9蛋白与gRNA形成复合体；其次，上述复合体切割与gRNA的spacer互补的基因组DNA序列；随后造成双链DNA的损伤；最后通过体内的NHEJ或HR修复机制将引入基因突变[]。
图 2 Cas9介导的基因组编辑原理[]
TypeⅢ CRISPR/Cas系统基本原理
TypeⅢ CRISPR/Cas系统包含的两种类型中以A型研究较为突出，这里以type Ⅲ-A为例。A型干扰的mRNA首先转录形成DNA，Cas10-Csm核糖核蛋白体，在crRNA的引导下对与crRNA互补的DNA双链或单链进行切割[]，从而造成DNA的损伤（）。
图 3 typeⅢ-A作用原理[]
CRISPR/Cas系统之间的比较
TypeⅡ CRISPR/Cas系统在最近几年研究火热，其突出的优点在于结构简单，系统容易设计，仅需要较短的gRNA和Cas9核酸酶就可以完成对特定靶基因的人工编辑，但是该系统存在较严重的脱靶把效应，使其广泛应用受到限制。
TypeⅢ CRISPR/Cas系统与其他两种类型相比存在自己独有的亮点：（1）TypeⅢ CRISPR/Cas系统只有在靶DNA转录的情况下才发挥功能。（2）Cas10-Csm复合物不仅具有执行引导RNA切割DNA的能力，也具有切割RNA的能力。这些突出的优点揭示了一种全能型的CRISPR免疫系统[]。
CRISPR/Cas系统最新突破性研究
随着生物学研究的迅猛发展，CRISPR/Cas系统也出现令人难以置信的新突破，为基因组编辑技术的广泛应用开辟了更为广阔的道路。
真核细胞具有较为复杂的转录调控系统，基因组中不同的位点采用不同的调控方式，利用这一原则，通过延长引导RNA使其包含效应蛋白的结合位点，从而开发了一种CRISPR支架RNA（scRNA），利用scRNA能够开发多基因转录程序，在控制一部分基因激活的同时又抑制了另一部分基因[]。这一突破为基因表达程序的构建提供了强有力的技术支撑，也为细胞重组和研究代谢途径等开辟新的道路。
在TypeⅡ CRISPR/Cas系统中Cas9具有重要的作用，初始的Cas9大多都是来源于酿脓链球菌即SpCas9，但是在金黄色酿脓葡萄球菌中发现了一种新的Cas9即SaCas9，在相关实验发现体内调节基因组编辑效率方面SaCas9要比SpCas9高出很多[]。一种高效的Cas9核酸酶的发现攻克了基因组编辑面临的一大挑战，在东京大学相关研究设计了一种光激活的Cas9，能够光控CRISPR/Cas9基因组编辑，在空间和时间上更好地控制RNA引导的核酸酶的活性[]；Sato实验室也相继推出了光活化系统来切割目标DNA序列，进行光活化的基因组修饰，他们采用每个Cas9片段与一个二聚化的结构域相融合，创建了光活化的Cas9工具；Alexander Deiters的实验室利用遗传编码的光照技术，在Cas9蛋白中插入硝基苯笼罩的赖氨酸，最终发现这种新型的Cas9系统能够让内源的基因表达沉默。这些技术的革新使人们能够更好的了解复杂的基因网络，也能很好的应用于医学方面。
基因组编辑技术在医学方面的应用也越来越多，如进行基因治疗和构建疾病模型等。
构建疾病模型
骨髓瘤是一种进行性肿瘤性疾病，目前对它的致病机理还不是很清楚，因此构建该疾病的模型，对于研究其致病机理和药物筛选有重要的作用。
小鼠的骨髓瘤疾病模型已被构建，研究小组将gRNA和表达Cas9蛋白的慢病毒表达载体构建出简易的TypeⅡ CRISPR/Cas系统，然后将表达5种微小gRNA慢性病毒载体组合在一起，导入小鼠的造血干细胞中，从而形成恶性肿瘤的单克隆；最后，将细胞注射到小鼠体内，结果表明CRISPR/Cas系统在多基因作用的模型建立上是有效的，能够较好的反应人类的疾病[]。
最近，Broad研究所和麻省理工学院David H.Koch综合癌症研究所的诸多科学家们利用Cas9核酸酶技术在构建的癌症动物模型中系统地“敲除”（关闭）了整个基因组的所有基因，从而揭示出与肿瘤进化和转移紧密相关的部分基因，同时也表明Cas9核酸酶筛选技术也成为在体内系统分析肿瘤进化过程中基因表型的可靠技术[]。为医学研究和临床治疗肿瘤，提供了新的思路和技术。
目前对于HIV-1型艾滋病的治疗尚不存在显著的治疗手段。Ebina等[]尝试利用CRISPR/Cas9技术对HIV-1感染的T细胞的LTR区进行打靶，结果显示它能有效降低细胞内前病毒的水平；韩英伦等[]利用CRISPR/Cas9技术对哺乳动物的造血干细胞进行改造，成功遏制了HIV-1病毒的感染作用，与此同时发现，它还能作用HIV-1原病毒的LTR区彻底清除原病毒，对CRISPR/Cas9技术进行改造实验发现它可以识别并激活HIV-1原病毒，如果结合HAART药物，结果能够彻底清除体内的HIV-1原病毒。
EB病毒感染能够引起肿瘤和非肿瘤性疾病，严重危害人类健康，Wang等[]利用CRISPR/Cas9技术体处理EB病毒潜伏感染的人类淋巴瘤细胞，结果发现有25%感染的细胞被清除，50%的细胞中，EB病毒负荷明显减少。由此可以预测，从人类感染的细胞中完全除去EB病毒，用于治疗相关疾病指日可待。
CRISPR/Cas9技术除了上述在病毒感染疾病基因治疗中取得显著成效以外，对一些遗传性疾病，例如：白内障、地中海贫血、囊性纤维病等基因突变引起的相关疾病研究中也已取得显著成果。
植物学研究
从基因组的角度出发对植物基因进行人工改造从而培育优良品种具有非常重要的意义，由于外源DNA与基因组靶基因发生同源重组效率很低，因此对植物基因组进行人工改造就显得异常困难。受序列的限制以往的CRISPR载体往往是两个载体，也即表达gRNA和Cas9元件位于不同的载体，共转化效率较低，为了克服这一困难，我们可以试想利用同源重组技术和改进后的定点突变技术将基因特异的靶序列构建到通用载体中得到表达特异基因gRNA的入门载体，将其与目标载体同源重组从而构造特异的基因表达载体。
CRISPR/Cas系统在植物学方向的研究很多，但大多局限于研究去修饰和改造一个或多个靶位点。最近，华南农业大学研究人员利用PCR技术扩增形成多重gRNA表达带，再将其组装到CRISPR/Cas9表达载体上，从而发现一种适合于单子叶和双子叶植物，高效且方便的多重基因组编辑的强大的CRISPR/Cas9系统[]，为后续进行植物基因组改造、整合和培育新的品种提供技术支撑。
昆虫学研究
在昆虫方向的研究大多局限于采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，目前已经在果蝇、家蚕、埃及伊蚊体内利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因敲除和插入研究，为进一步研究基因功能提供新的思路和技术手段。
2014年，Liu等[]在家蚕细胞中利用CRISPR/Cas9系统进行6个基因的敲除，在敲除Bm702基因的同时实现外源基因在该位点的成功插入；2015年，辛虎虎[]在家蚕丝腺相关基因Bmsage的研究中采用CRISPR/Cas9系统进行基因的敲除和功能分析取得良好效果；2015年，Kistler等[]在埃及伊蚊产卵后的3 h内注射gRNA与Cas9，敲除Wtrw基因并插入包含stop位点的ssODN供体片段，采用Cas9核酸酶系统对目的DNA进行切割和HR修复，在埃及伊蚊内插入ECFP阅读框，子代可在荧光显微镜下显示特殊的蓝色，便于形态学观察。利用CRISPR/Cas系统对昆虫基因功能的研究和注释，为人类了解和探究大自然产生深远的影响。
目前，CRISPR/Cas系统相关的基因组编辑技术已在多个研究领域广泛应用，尽管其中潜在着许多待解决的问题，如TypeⅡ CRISPR/Cas系统中DNA解旋是本身具有解旋能力还是由于DNA复制或转录的过程引发DNA解旋[]，如何确保临床应用中的安全性和有效性等；作为RNA编辑的TypeⅢ CRISPR/Cas系统目前仍有分子机制尚不明确。但作为第三代基因组编辑技术工具无论是从方法上还是实验成本上都是传统基因修饰和第二代基因组编辑技术无法取代的。
基因组编辑技术普遍存在细胞毒性和脱靶效应两大问题，由于CRISPR/Cas9系统自身存在脱靶效应，也使其在推广研究应用中受到或多或少的限制，对于降低TypeⅡ CRISPR/Cas系统的脱靶效应，可以考虑以下几个方面：（1）适当减少Cas9蛋白和gRNA的递送量。（2）对打靶位点进行严谨的筛选和过滤。（3）Cas9n和gRNA配对使用，形成5'端突出的末端。（4）精确设计和控制gRNA的长度以此降低gRNA和非目标序列的结合率。
CRISPR/Cas系统目前多数还处于基础研究，有些深层次的技术还有待于开发和应用，例如TypeⅠCRISPR/Cas系统还未见报道，2015年TypeⅢ CRISPR/Cas系统在Cell上发布有突破性进展，但随着基础学科的不断深入，CRISPR/Cas系统也会得到更为广阔的发展和应用前景。CRISPR/Cas系统的不断优化和提升，对未来医学领域：医学研究与医学临床治疗、药物开发、耐受药物细胞模型的建立与筛选、人源化器官的克隆移植；分子标记领域：药物靶向追踪、活细胞中特定结构基因构象分析；基因组学领域：功能基因研究、高通量功能基因鉴定与筛选、基因组改造与整合，CRISPR/Cas系统都已表现出巨大的应用潜力和研究开发价值。
谢科, 饶力群.
基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景.
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