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【求助】转染了绿色荧光蛋白后，用多聚甲醛固定，共聚焦显微镜检测细胞内荧光，为什么在细胞核里也特别亮？
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这个帖子发布于2年零97天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
要检测自噬Marker LC3在细胞质中点状聚集，所以转染了GFP-LC3质粒，本来应该在细胞质中分布，但是除了细胞质中有荧光外，在细胞核中也检测到了很强的荧光信号，这是怎么回事？ 我是用多聚甲醛固定15分钟后观察的。没有用Triton X-100等透膜剂。
不知道邀请谁？试试他们
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有没有可能是自发荧光/
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wangkai0418 有没有可能是自发荧光/谢谢你的回答。我感觉肯定是非特异性显色，是哪里的问题呢，难道是多聚甲醛固定的时间太长了？我看网上都是说15分钟到20分钟呀。而且我如果不固定，转染到时间后直接拍共聚焦，就不会观察到入核。可是我直接拍活细胞的话，从培养箱拿出来放的时间久了细胞状态就会很不好，所以必须要固定后拍照，这个固定时间要调整到多长合适呢，就是既达到了固定的目的，又不至于在细胞核里观察到荧光信号。
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你做的什么细胞？实验的目的是什么？用的什么仪器？活细胞工作站 就可以直接检测活细胞的
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丁香园版主
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绿色荧光蛋白应该是质粒自带的把？你观察到细胞核中有绿色荧光，不能说明那是你目的蛋白把？检测你的目的蛋白Marker LC3表达，应该用LC3抗体或者质粒自带标记抗体把？ 作慢病毒也是这样，绿色荧光也主要表达在细胞核，但这个跟要沉默的目的蛋白定位没有关系
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wangkai0418 你做的什么细胞？实验的目的是什么？用的什么仪器？活细胞工作站 就可以直接检测活细胞的 用的激光共聚焦显微镜，目的就是检测细胞自噬发生时，LC3点状聚集，因为仪器和本实验室不在同一地点，拿着活细胞过去，那边又没有培养箱，细胞在外面一直放着状态都改变了。活细胞工作站倒是有，可是拍摄的照片不如confocal清楚。
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小红赛 绿色荧光蛋白应该是质粒自带的把？你观察到细胞核中有绿色荧光，不能说明那是你目的蛋白把？检测你的目的蛋白Marker LC3表达，应该用LC3抗体或者质粒自带标记抗体把？ 作慢病毒也是这样，绿色荧光也主要表达在细胞核，但这个跟要沉默的目的蛋白定位没有关系 是质粒自带的，质粒上既有GFP，又有LC3，所以照理说，GFP的分布也就反应了LC3的分布。然而，LC3应该主要在细胞质中分布，可是我拍的细胞核里也可亮了，这不科学。并且，我不固定时拍的照片显示，细胞核里没有绿色荧光。
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楼主你好，我最近拍共聚焦也发现了这个问题，似乎多聚甲醛固定后蛋白出现了位移，虽然没有转移到核里面这么严重，但明显跟细胞器之间的定位发生了变化，不知道你有没有相关的经验呢？
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深海之梦 楼主你好，我最近拍共聚焦也发现了这个问题，似乎多聚甲醛固定后蛋白出现了位移，虽然没有转移到核里面这么严重，但明显跟细胞器之间的定位发生了变化，不知道你有没有相关的经验呢？激光共聚焦拍的是断层，如果没有出现在细胞核，应该细胞核不会出现亮点吧？我最近也遇到了这样的问题，而且绿色很多。不知道楼主是否已经解决？可否不吝赐教？
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是否已经解决？
我最近也遇到了同样状况
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止于春风 请问楼主
是否已经解决？
我最近也遇到了同样状况后来将多聚甲醛固定时间缩短为5分钟会好一些，你可以试试
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楼主我的情况和你一样，不知道是不是固定的原因
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联系电话010-如何区分感染和未感染病毒的细胞(病毒,荧光蛋白,流式细胞仪,荧光测定) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 如何区分感染和未感染病毒的细胞(病毒,荧光蛋白,流式细胞仪,荧光测定)
摘要: [如何区分感染和未感染病毒的细胞(病毒,荧光蛋白,流式细胞仪,荧光测定)] 相关疾病：感染目前大多是接荧光蛋白，然后进行荧光测定，一般实验室难以达到。是不是有简单的方法，比如感染病毒的细胞内部DNA发生变化，可以用流式细胞仪检测出来呢？只是假设。能否做到不改变任何结构，就可以对二者进行定量？ 关键词:[病毒 荧光蛋白 荧光测定 流式细胞仪]……
目前大多是接荧光蛋白，然后进行荧光测定，一般实验室难以达到。是不是有简单的方法，比如感染病毒的细胞内部DNA发生变化，可以用流式细胞仪检测出来呢？只是假设。能否做到不改变任何结构，就可以对二者进行定量？
回复目前大多是接荧光蛋白，然后进行荧光测定，一般实验室难以达到。是不是有简单的方法，比如感染病毒的细胞内部DNA发生变化，可以用流式细胞仪检测出来呢？只是假设。能否做到不改变任何结构，就可以对二者进行定量？应该是有一些手段可以检测的，不过感觉有点舍近求远似的。标记荧光不是很好的吗？一般实验室检测不了，可以去别的实验室检测啊。再说，买个荧光显微镜也不是很贵的啊！回复
可以考虑一下用地高辛标记，这样就可以通过肉眼看到结果，当然还是通过电镜观察！！！没有一个方法是可以偷懒的，毕竟都是到了细胞水平的东西，不是那么容易观察的了，没有荧光显微镜的话，就只有用放大倍数更高点电镜晒！！！还有种用地高辛和酶标记，通过一种特殊的地高辛和一种酶连接后可以进行特殊的酶促反映，就可以通过肉眼观察！！！但是这种方法我没有查到，你自己查哈！！下面的是用电镜观察的方法哈！！！其基本原理首先利用地高辛修饰核酸探针，与细胞或组织进行杂交，再用抗地高辛抗血清相连胶体金与之结合，进行细胞或组织特异核苷酸的超微结构定位。为增强金的显示效应，可用银加强法增强金粒的显示效应。基本操作方法（Fischer D et al, 1992）1．组织处理（1）固定：固定剂采用4%多聚甲醛（PFA，用PBS配制）加0.5%戊二醛（GA），保存在4℃。作者采取浸入法，即取大鼠肝脏放入冷固定剂中（4%PFA，不含GA），切成1mm3左右的小方块。修整好的组织块移入另一玻皿中，内盛有4%PFA和0.5%GA,固定2h。（2）PBS（4℃）漂洗3～5min。（3）脱水 时间乙醇浓度温度　　2×15min　　　　　30%　　　　　　　　4℃　　30min 　　　　　　30%　　　　　　　　4℃　　30min 　　　　　　50%　　　　　　 　-20℃　　2×30min　　　 70%，90%，96%，100%　　 -20℃　　注意勿使酒精挥发致使组织干燥。（4）浸透和包埋（Carlemalarm et al, 1989）：由于K4M包埋剂有挥发性，因此，此步操作者必须带手套，在通风柜中进行，注意K4M包埋剂不要靠近O2，一切在低温下进行，最好设有恒低温的冷柜。①Lowcryl K4M配方　　1）交联剂A　　　 2g　　2）单体B　　　　 13g　　3）引发剂　　0.075g　　混合1)，2)后，再加“3）”轻搅匀，混匀后置于-20℃。　　②浸透（infiltration），在-20℃进行　　时间液体　　1h　　　　　　100%乙醇：K4M（1：1，V/V）　　2×1h　　　　　K4M　　过夜 　　　　 K4M　　2×3h　　　　 K4M　　③包埋： 先将胶囊冷却，滴入几滴K4M，然后每个胶囊内放入一个组织块，以K4M充满胶囊，在室温放置30min，使包埋剂中气泡逸出。然后置于0℃-40℃之间，利用紫外线灯360nm波长照射5天，温度必须保存恒定。然后移至室温使温度回升，胶囊变硬。　　④切片：由于胶囊是透明的，包埋在内的肝组织很容易识别。修块后进行切片，由于K4M是亲水性的，在切片过程中注意组织块表面一定不要让水浸湿，用200个网眼的镍网覆以For－mvar膜和碳膜捞取切片，空气干燥备用于杂交。　　2．探针准备rRNA探针以Dig-UTP标记，注意探针不宜过长，否则影响对组织的穿透性。如过长，可事先用第二十章　介绍的探针水解法处理。　　3．杂交本步骤均在湿盒内进行，将杂交液滴滴于蜡膜上，将镍网载有切片面覆于液滴上，在65℃杂交至少3h。杂交液含：5×SSC，0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP反意探针10ng/μl(et 1×SSC配，含150mmol/L NaCl, 15mmol/L醋酸钠)。　　4．杂交后漂洗　　在室温用2×SSC漂洗3×5min，然后用PBST（PBS,0.1%Tween）漂洗2×10min。　　5．显示　　①以PBST加BT封闭（BT配方：PBST，1%BSA）孵育15min。　　②应用抗地高辛抗体结合直径1mm的金粒，以PBST加BG稀释为1：30，室温孵育1h。　　③以PBST漂洗3×5min。　　④以带笔尖嘴软塑料壶冲洗6×15min。　　⑤以银增强法，在暗室中孵育于显影液：促进液（Enhancer）1：1,4～20min。　　⑥重复④。　　⑦以2%醋酸铀（4min），枸缘酸铅1min染色，漂洗，空气干燥。　　⑧电镜观察。回复非常感谢楼上二位TO二楼：不是每一种病毒都好接荧光的吧？而且我们实验室好像也做不了。正因为做不了荧光的，所以才想求助其它的方法。当然如果能做更好，只是方法的建立，比较费事。TO三楼：我是直接用病毒颗粒的，好像没有组织这方面的东西，是否你的方法仍是可用？也就是液里有病毒感染的细胞，也有未感染病毒的细胞，我想做个定量。回复
我知道，我也是用病毒来感染细胞的，我们老师就是用地高辛来做的当然是用的红字那种，下面那种是书上的，红字那种应该很好用！！回复红字的那种能详细的介绍一下吗？谢谢
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电话：021-一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法
本发明公开一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体方法包括制备荧光磁性微球；制备荧光检测抗体；制备荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度，本发明将流式细胞术与荧光免疫磁性微球相结合检测蛋白质浓度，采用该方法进行特异性蛋白质分子浓度检测，反应体系小，测量更精准，检测下限为pg/ml级，具有较高的特异性和敏感性，操作更方便快捷，操作步骤简化，直接孵育无需分步孵育洗涤，缩短反应时间，检测结果时间更短，定量更精确。
专利类型：
申请（专利）号：
申请日期：
公开(公告)日：
公开(公告)号：
主分类号：
G01N15/14,G01N15/00,G,G01,G01N,G01N15
G01N15/14,G01N15/00,G01N33/68,G01N33/00,G,G01,G01N,G01N15,G01N33,G01N15/14,G01N15/00,G01N33/68,G01N33/00
申请（专利权）人：
发明（设计）人：
主申请人地址：
710061 陕西省西安市雁塔西路277号
专利代理机构：
国别省市代码：
一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，其特征在于：联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体包括以下步骤：步骤(1)：将荧光染料修饰在磁性微球上制备荧光磁性微球；步骤(2)：将荧光基团交联在蛋白质特异的单克隆抗体上制备荧光检测抗体；步骤(3)：将步骤(1)获得的荧光磁性微球表面进行氨基化和酰胺-羧基化修饰，再分别将该蛋白质不同荧光检测抗体对应表位的特异性单克隆抗体和特定荧光标记量的荧光检测抗体交联在活化的荧光磁性微球表面，制成荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；步骤(4)：制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度。
法律状态：
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