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【求助】从提取总RNA=》RT=》PCR的电泳图，请高手帮忙看图解答，谢谢！
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丁香园准中级站友
这个帖子发布于8年零216天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是从肿瘤细胞中提取的总RNA，用英伟创津的Trizol提取，每孔取10微升加样电泳，用1.0%的普通琼脂糖电泳，0.5×的TBE，TBE和琼脂均用的DEPC水配制，上样缓冲液用的是DNA的loading buffer，DL 2000 Marker。结果测了浓度普遍偏低波动于300－1000之间，纯度波动于1.5－1.9之间。想大家结合电泳图帮看看提得质量怎样？奇怪的是我的第五个Marker孔没有出现应有的条带竞也出现3条带？还有就是浓度低不知是否是检测仪出了问题，先前提了两个测得3000多ng/ul浓度的RNA置于－80度保存一周后再拿来测竞也仅剩1000，搞不明白！提了7，8个RNA后因为检测的浓度均为1000ng/ul左右或低于1000ng/ul，所以没有做RT，请问浓度在1000ng/ul左右或低于1000ng/ul还能做RT或者做了有意义吗？问题很多，静待高手作答！并请核酸版版主为回答者加分鼓励，感谢！（注：5-8和6-10分别为两株细胞系的名称，而非泳道）
不知道邀请谁？试试他们
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chjipe 编辑于
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1、跑胶的结果未见明显的降解情况，带型也都很完整，建议下次用变性胶跑，缓冲液使用1xmops，也许带型会分的更加清楚些。样品的浓度在300ng-1000ng之间，排除你开始使用肿瘤细胞的总量偏少情况，这个浓度确实偏低些，但是不影响你反转的效果，一般反转试剂盒要求的总RNA量在500ng-5ug之间就可以了，个人习惯用3ug总RNA来反转。2、有两个样品在-80°保存一周后再测量浓度就只有之前的1/3了，这个绝对是有降解的情况发生，抽提好的RNA样品在-80°起码可以保存2个月，这个我做过实验，所以如果排除你测量的误差情况，你要改进下你抽提的步骤，以防RNA降解。3、未上样的5号孔也有条带，估计是你点样太多或是上样不小心，其它孔的样品漂到5号孔导致。4、OD值在1.5-1.9波动，这个波动范围太大了吧，建议你使用PH7.5的TE缓冲液做测量的稀释液而不要使用DEPC水，DEPC水呈现酸性，会导致你测量的比值偏低。很奇怪，我使用DEPC水做测量缓冲液，比值全部都是落在1.45-1.5之间，换TE缓冲液比值就在2.1-2.2之间，这个就和理论的预期很符合。我估计你测量的缓冲液是使用DEPC水，那这个比值也偏高了些，是不是有降解的情况发生呢？个人猜测。
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havocking 编辑于
1、如你所说的，那就应该排除讲解的情况了，可能你第一次测量的结果有误，如果产生讲解了，那就会测量的值慢慢减小的趋势。2、仪器估计有问题了，重复测量同一份样品，值肯定不可能会完全一样，但是一般误差在5%以内，如果差很多了，那就要考虑下仪器的问题了。4、以后测量最好还是选DEPC水配制的TE缓冲液吧，这样缓冲体系会让结果更加稳定。通过反转后的cDNA跑胶看不出两份样品是否有讲解，跑胶结果显示都还可以啊，最好用几对常见看家基因的引物来做下PCR验证下，一般可以扩出，那说明反转无误。
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RT-PCR是一种非常灵敏的实验，这个浓度做没有问题。
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做RT一般每微升500-1000纳克足够了，这个浓度没有问题的，关于你MARKER里面也出现了三条带，本人认为可能是你在点样的时候，挨着MARKER那个泳道的样品有点溢出，将其污染了，所以也跑出了这样的三条带！还有你提的RNA 质量可以啦，做RT肯定没有问题的，RT对RNA的要求并不是很高，放心做吧，祝你好运！
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1、跑胶的结果未见明显的降解情况，带型也都很完整，建议下次用变性胶跑，缓冲液使用1xmops，也许带型会分的更加清楚些。样品的浓度在300ng-1000ng之间，排除你开始使用肿瘤细胞的总量偏少情况，这个浓度确实偏低些，但是不影响你反转的效果，一般反转试剂盒要求的总RNA量在500ng-5ug之间就可以了，个人习惯用3ug总RNA来反转。2、有两个样品在-80°保存一周后再测量浓度就只有之前的1/3了，这个绝对是有降解的情况发生，抽提好的RNA样品在-80°起码可以保存2个月，这个我做过实验，所以如果排除你测量的误差情况，你要改进下你抽提的步骤，以防RNA降解。3、未上样的5号孔也有条带，估计是你点样太多或是上样不小心，其它孔的样品漂到5号孔导致。4、OD值在1.5-1.9波动，这个波动范围太大了吧，建议你使用PH7.5的TE缓冲液做测量的稀释液而不要使用DEPC水，DEPC水呈现酸性，会导致你测量的比值偏低。很奇怪，我使用DEPC水做测量缓冲液，比值全部都是落在1.45-1.5之间，换TE缓冲液比值就在2.1-2.2之间，这个就和理论的预期很符合。我估计你测量的缓冲液是使用DEPC水，那这个比值也偏高了些，是不是有降解的情况发生呢？个人猜测。
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havocking 编辑于
用trizol试剂提完后的RNA溶于DEPC水，双蒸水做稀释液，取其中的2ul，50倍稀释后一般OD比值在1.7左右，他们做临床标本的也都是这么做的，比值也还好。本人还没用TEbuffer测过，个人感觉OD值只是一个参考，不是太准，可能也更机器有关吧！
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丁香园准中级站友
havocking 1、跑胶的结果未见明显的降解情况，带型也都很完整，建议下次用变性胶跑，缓冲液使用1xmops，也许带型会分的更加清楚些。样品的浓度在300ng-1000ng之间，排除你开始使用肿瘤细胞的总量偏少情况，这个浓度确实偏低些，但是不影响你反转的效果，一般反转试剂盒要求的总RNA量在500ng-5ug之间就可以了，个人习惯用3ug总RNA来反转。我提取时细胞总量是够的，第一次提的两个RNA浓度都是3000多，OD比值为1.74和1.82，感觉还不错。但第二次和第三次提就不行了，要么浓度过低普遍几百甚至还出现负值，要么OD比值差1.5、1.6的，然后怀疑检测机器出了问题就把几天前那两个比较成功的RNA拿出来测浓度就剩三分之一约1000左右了。现在过完年又过了半个月还不死心又把那两个“降解”很快的RNA拿来测，浓度却还是1000多一点，按理应该会一直降解吧？2、有两个样品在-80°保存一周后再测量浓度就只有之前的1/3了，这个绝对是有降解的情况发生，抽提好的RNA样品在-80°起码可以保存2个月，这个我做过实验，所以如果排除你测量的误差情况，你要改进下你抽提的步骤，以防RNA降解。我就是不能排除测量的误差啊，昨天又拿那个仪器测RNA，结果随着检测次数的增多，OD值只增不减，浓度也呈现上升趋势。我觉得肯定有问题！但别人测了都没发现什么问题。实验室又懒得找人来检测，真是郁闷。4、OD值在1.5-1.9波动，这个波动范围太大了吧，建议你使用PH7.5的TE缓冲液做测量的稀释液而不要使用DEPC水，DEPC水呈现酸性，会导致你测量的比值偏低。很奇怪，我使用DEPC水做测量缓冲液，比值全部都是落在1.45-1.5之间，换TE缓冲液比值就在2.1-2.2之间，这个就和理论的预期很符合。我估计你测量的缓冲液是使用DEPC水，那这个比值也偏高了些，是不是有降解的情况发生呢？个人猜测。调零我第一次用的DEPC水也测出过1.8左右的OD值，换成蒸馏水OD还是没多大变化啊？另外今天做了前面两个还可以的RNA的反转录，拿cDNA去电泳，好像左边那条弥散了，右边好像还正常点，是不是意味着我左边的RNA降解了？还是怎样？高手帮忙看下
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chjipe 编辑于
1、如你所说的，那就应该排除讲解的情况了，可能你第一次测量的结果有误，如果产生讲解了，那就会测量的值慢慢减小的趋势。2、仪器估计有问题了，重复测量同一份样品，值肯定不可能会完全一样，但是一般误差在5%以内，如果差很多了，那就要考虑下仪器的问题了。4、以后测量最好还是选DEPC水配制的TE缓冲液吧，这样缓冲体系会让结果更加稳定。通过反转后的cDNA跑胶看不出两份样品是否有讲解，跑胶结果显示都还可以啊，最好用几对常见看家基因的引物来做下PCR验证下，一般可以扩出，那说明反转无误。
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丁香园准中级站友
再次感谢高手相助！反馈结果！第二张图中两份样品，经过GAPDH跑PCR验证，右边那份可见条带的样品不能用了，估计可能降解了，反而左边那条已经smear的跑得不错，是否可以得出结论：cDNA电泳结果样品出现smear属正常现象，证明样品没问题；而出现条带则考虑样品降解？附上图片。
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chjipe 编辑于
chjipe 再次感谢高手相助！反馈结果！第二张图中两份样品，经过GAPDH跑PCR验证，右边那份可见条带的样品不能用了，估计可能降解了，反而左边那条已经smear的跑得不错，是否可以得出结论：cDNA电泳结果样品出现smear属正常现象，证明样品没问题；而出现条带则考虑样品降解？附上图片。反转出来的cDNA跑胶本来就是smear，因为不同的mRNA长度是不同的，所以出现smear是正常的。其实我认为出现条带反而是反转情况比较好，但是不知道为何你用GAPDH扩增反而没结果？我记得好像在一片文献上看到，一般从总mRNA反转来的cDNA，跑胶检测的时候呈现smear，并且在600bp和1200bp处出现明显的主带，和你右边的情况很很符合，但是不知为什么你扩增反而无结果。希望其它高手给出合理的解释？（当然你应该多做几次重复，以排除无带的结果不是由于PCR随机误差导致）
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havocking 4、OD值在1.5-1.9波动，这个波动范围太大了吧，建议你使用PH7.5的TE缓冲液做测量的稀释液而不要使用DEPC水，DEPC水呈现酸性，会导致你测量的比值偏低。很奇怪，我使用DEPC水做测量缓冲液，比值全部都是落在1.45-1.5之间，换TE缓冲液比值就在2.1-2.2之间，这个就和理论的预期很符合。我一直用DEPC水，比值在2.1-2.2之间，比值低是因为，RNA用70%酒精洗涤后没有晾干，晾得稍干一些就好了。
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zhao 我一直用DEPC水，比值在2.1-2.2之间，比值低是因为，RNA用70%酒精洗涤后没有晾干，晾得稍干一些就好了。这个解释有点意思，不过我不太认同是因为酒精没晾干导致使用DEPC水测量值偏低。希望有更多的人提出个人见解。
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havocking 这个解释有点意思，不过我不太认同是因为酒精没晾干导致使用DEPC水测量值偏低。希望有更多的人提出个人见解。提RNA我有时一周提好几次，提了两年了，这个我试过多次，有兴趣的可以试一试。nanodrop全波长扫描测的。
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zhao 编辑于
丁香园准中级站友
zhao 提RNA我有时一周提好几次，提了两年了，这个我试过多次，有兴趣的可以试一试。nanodrop全波长扫描测的。zhao战友的意思是酒精没晾干导致使用DEPC水测量值偏低吗？是否经过验证？能否告知原因？影响到底又有多大呢？我今天又提了两个，晾干5min后，有一个残留酒精多，一个少（因为赶时间没有继续晾干就测了浓度），结果酒精多的确实260/280的OD比值低，只有1.50左右；而另外一个也是一起提的样品则在1.72左右。那么，如果酒精没晾干会导致使用DEPC水测量值偏低的话，对于这个只有1.50左右的样品，还能用吗？还是保险点重新提一次呢？我觉得同一批提的样品应该不会差别太大才对。也谢谢核酸版版主置顶讨论。我会在此贴不断反馈我的结果，（明后天准备将这两个样品和反转录后的cDNA跑电泳看看）也希望能有更多的高手加入讨论，一起学习提高！
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havocking 反转出来的cDNA跑胶本来就是smear，因为不同的mRNA长度是不同的，所以出现smear是正常的。其实我认为出现条带反而是反转情况比较好，但是不知道为何你用GAPDH扩增反而没结果？我记得好像在一片文献上看到，一般从总mRNA反转来的cDNA，跑胶检测的时候呈现smear，并且在600bp和1200bp处出现明显的主带，和你右边的情况很很符合，但是不知为什么你扩增反而无结果。希望其它高手给出合理的解释？（当然你应该多做几次重复，以排除无带的结果不是由于PCR随机误差导致）除了跑GAPDH，我也做了加入根据目标基因设计合成的引物的PCR，结果同样是6-10的有条带，5-8的没有（图中第3泳道为5-8，第4泳道为6-10）。所以后面才做的GAPDH的PCR来验证这两个样品，结果也吻合，估计就是样品的问题了。但有些奇怪，6-10和5-8做反转录之前浓度差不多都为1000ng/uL，纯度均为1.70-1.80之间，而反成cDNA后测浓度，反而5-8浓度高，约为2300ng/uL，而6-10仅为1200ng/uL，当时还以为5-8提的要比6-10好呢，结果正好相反，我也搞不明白，请高手解答。
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chjipe 编辑于
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我从开始提到现在，提了有4-5次，从没看过人家操作，自己照着说明书一步步摸过来的，但奇怪只有第一次提的最好，两个样均在3000多ng/uL，OD比值一个1.74（5-8），一个1.82（6-10）.其后提的几次要么就是浓度太低（只有几十到几百），要么就是纯度太低（大部分都是1.60-1.70之间）。请教浓度500ng/uL以下是不是主要由于细胞数量少？是否还有其他原因？500ng/uL以下能不能用？纯度低，大多1.6几，考虑到可能由于zhao战友所说的酒精残存太多或者由于如havocking战友所说的我配的用来调零的DEPC水偏酸造成（下次做前加强酒精干燥以及测下DEPC水的PH争取达到好的效果），那我这几次做的浓度几百和纯度1.6几的样品还能不能用了？也不知结果可信不呢？是不是只要P得出来就OK了？毕竟我提了十几种细胞的RNA，一下子要养这么多细胞容易让人崩溃啊，呵呵！
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chjipe 编辑于
chjipe zhao战友的意思是酒精没晾干导致使用DEPC水测量值偏低吗？是否经过验证？能否告知原因？影响到底又有多大呢？我今天又提了两个，晾干5min后，有一个残留酒精多，一个少（因为赶时间没有继续晾干就测了浓度），结果酒精多的确实260/280的OD比值低，只有1.50左右；而另外一个也是一起提的样品则在1.72左右。那么，如果酒精没晾干会导致使用DEPC水测量值偏低的话，对于这个只有1.50左右的样品，还能用吗？还是保险点重新提一次呢？我觉得同一批提的样品应该不会差别太大才对。也谢谢核酸版版主置顶讨论。我会在此贴不断反馈我的结果，（明后天准备将这两个样品和反转录后的cDNA跑电泳看看）也希望能有更多的高手加入讨论，一起学习提高！我一般是加入70%酒精后离心，然后弃上清，再离心，用20uL枪小心吸掉残液，然后晾大约10min钟，尽量干燥，再用DEPC水溶解。DEPC水我一般灭30min。这是经验，到底什么原因我不清楚，也不敢乱说。不太熟的可以少量提试一下。做RT-PCR如果要定量的话，你保持你的样品间操作一致应该就可以，不要把两次提的RNA一起做。应该攒够样品一起提。冻融的次数也要一致。比值低有时是操作的问题，不是降解。里面有少量酒精对反转录也不会有太大影响。如果不做定量的话，你做反转录应该一点问题也没有。
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zhao 编辑于
chjipe 我从开始提到现在，提了有4-5次，从没看过人家操作，自己照着说明书一步步摸过来的，但奇怪只有第一次提的最好，两个样均在3000多ng/uL，OD比值一个1.74（5-8），一个1.82（6-10）.其后提的几次要么就是浓度太低（只有几十到几百），要么就是纯度太低（大部分都是1.60-1.70之间）。请教浓度500ng/uL以下是不是主要由于细胞数量少？是否还有其他原因？500ng/uL以下能不能用？纯度低，大多1.6几，考虑到可能由于zhao战友所说的酒精残存太多或者由于如havocking战友所说的我配的用来调零的DEPC水偏酸造成（下次做前加强酒精干燥以及测下DEPC水的PH争取达到好的效果），那我这几次做的浓度几百和纯度1.6几的样品还能不能用了？也不知结果可信不呢？是不是只要P得出来就OK了？毕竟我提了十几种细胞的RNA，一下子要养这么多细胞容易让人崩溃啊，呵呵！
我沉淀的步骤基本和zhao同学的差不多，也是用枪头吸取残留的酒精后倒扣一会，加DEPC水溶解，不过倒扣时间没10min那么长。基本上我认为这个时候已经可以忽略乙醇的干扰了。只是在后续的溶解方面，我一般习惯放在60度水浴处理10min，以便让RNA充分溶解，干燥的RNA不是那么容易溶解的，60度水浴有助其充分溶解。其实我们回忆下，测量核酸浓度的缓冲液，标准是应该使用TE缓冲液而不是单纯的双蒸水，缓冲体系的PH值对测量的OD值影响应该是最大的，至于DEPC水呈酸性而影响到OD值偏低，也是我看到上海孤儿在他的帖子里给出的一个解释吧，我直接拿来用了。不过这种解释和我自己的实际很符合，我抽提的都是植物组织的RNA，用DEPC水和TE测的结果基本上都是我上面描述的这样，难道和物种也有关系？不过我倒是认为，纯净的RNA测量的OD比值应该是在2左右，差太多都不合适，下次可以试试用TE做缓冲液测量一把看看值在多少。
至于反转这个东西已经是一个很成熟的商业化体系了，按照试剂盒的要求做下去就行了，反转的产物用几对常用的看家基因扩增检测下，如果都ok那基本上就没问题了，可以直接拿来做后续的定量实验了，不必纠缠于原始的总RNA浓度大小的问题。
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havocking 编辑于
我做的是动物细胞的，RNA是DNase消化并抽提过的。没消化的比值会低。植物的没搞过。
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zhao 编辑于
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今日做了一天，刚刚回到寝室。继续反馈实验结果！在此不禁要赞一下havocking战友！因为havocking战友本贴前面提到：“认为5-8出现条带反而是反转情况比较好”。但我5-8的PCR的产物电泳并看不到条带，包括cDNA加入GAPDH引物依然未有条带，故我考虑战友意见，对5-8的RNA再次反转录，跑PCR，结果这次终于做出了结果，5-8和6-10均出现了GAPDH的条带，也反证了havocking战友的观点和我之前反转录可能出现的失误。高手就是高手！请版主加分！！
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chjipe 编辑于
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明后天看细胞情况准备继续开始提RNA，同时采纳havocking战友和zhao战友的观点，购进了TE缓冲液代替DEPC水以及准备再次离心以去净酒精，力争能有好的结果！到时会及时反馈大家。也希望本贴可以帮到更多的人，这也算是对两位高手战友最大的报答吧！我今天又重新拿出年前提的其他要么浓度低要么纯度差的RNA，但电泳图感觉好像还不错，再请几位高手过目指点！（加样孔是不是有少许残留？和第一张图比质量又如何？）
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chjipe 编辑于
chjipe 明后天看细胞情况准备继续开始提RNA，同时采纳havocking战友和zhao战友的观点，购进了TE缓冲液代替DEPC水以及准备再次离心以去净酒精，力争能有好的结果！到时会及时反馈大家。也希望本贴可以帮到更多的人，这也算是对两位高手战友最大的报答吧！我今天又重新拿出年前提的其他要么浓度低要么纯度差的RNA，但电泳图感觉好像还不错，再请几位高手过目指点！（加样孔是不是有少许残留？和第一张图比质量又如何？）个人认为RNA胶能跑到这个程度，说明抽提的结果已经很好了，勿需在抽提的手法这一块进行较大的变动，保持这个过程即可。点样孔略微有点残留，属于未抽提干净的杂质，可以接受，如果非要追求完美，可以在用异丙醇沉淀这一步，同时加入的等体积的高盐溶液一起沉淀以去除蛋白质多糖；也可在开始用氯仿抽提的时候加多2次氯仿抽提，估计会对结果略有改进。
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havocking 个人认为RNA胶能跑到这个程度，说明抽提的结果已经很好了，勿需在抽提的手法这一块进行较大的变动，保持这个过程即可。点样孔略微有点残留，属于未抽提干净的杂质，可以接受，如果非要追求完美，可以在用异丙醇沉淀这一步，同时加入的等体积的高盐溶液一起沉淀以去除蛋白质多糖；也可在开始用氯仿抽提的时候加多2次氯仿抽提，估计会对结果略有改进。恩，感谢havocking兄一直以来的指导！打算明天再次提取RNA，到时加上氯仿多抽提2次试试杂质会不会少点。对了，请教TE的工作浓度应该为多少？
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我也碰到过用紫外分光光度计测量RNA浓度漂浮不定的情况，也不知道是紫外坏了，还是另有玄机。。。后来我就干脆不管了。。。另外RAN的浓度是怎么也够来做RTPCR的，都有单细胞的RTPCR。
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chjipe 恩，感谢havocking兄一直以来的指导！打算明天再次提取RNA，到时加上氯仿多抽提2次试试杂质会不会少点。对了，请教TE的工作浓度应该为多少？就是分子克隆上面的那个浓度，TE只有一个配方啊：10mM的Tris.Cl和1mM的EDTA，调PH到7.5即可。
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havocking 就是分子克隆上面的那个浓度，TE只有一个配方啊：10mM的Tris.Cl和1mM的EDTA，调PH到7.5即可。呵呵，我偷懒了，看着人家试剂公司有且不贵就购了点（100ml就20多元，且已灭菌），那我直接开启使用就OK吧，成品还需要调PH吗？谢谢！
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jinhoucong 我也碰到过用紫外分光光度计测量RNA浓度漂浮不定的情况，也不知道是紫外坏了，还是另有玄机。。。后来我就干脆不管了。。。另外RAN的浓度是怎么也够来做RTPCR的，都有单细胞的RTPCR。恩，谢谢jinhoucong战友！我实验需要比较4株肿瘤细胞中某一目的基因的表达差异，所以我准备明天同时提取这4株细胞的RNA，同时检测浓度和纯度，同时RT-PCR，同一块胶跑电泳。这样应该可以忽视非同次操作、机器误差以及其他影响因素了吧？所以我不论明天浓度、纯度如何，决心将“提取总RNA=》RT=》PCR=》电泳”进行到底！当然跑PCR产物电泳时还会把这4个细胞的RNA一块跑，作为副产品进行验证。
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比较基因表达差异，我打算先做个半定量PCR大概看看有没有差异，如果有再继续跑real PCR。复习了理论和文献，细节如下：准备加GAPDH内参作参照，与目的蛋白分开两管跑，但反应条件保持一致（同一PCR机，GAPDH跑25个cycle后取出，目的基因跑30个cycle，GAPDH取出后目的基因继续跑完剩下5个cycle），退火温度按照目的基因摸的温度。然后同一块新鲜胶中跑电泳约45min后紫外验证拍照，目的基因与GAPDH加入同一泳道，取照片目的条带进行灰度分析，取不同泳道（细胞）的目的条带和GAPDH条带比值进行统计学分析，得出是否有差异。因为仅仅是计划，暂时停留在理论阶段，而且计划经常没有变化快。所以恳请高手帮忙看看有什么问题和细节必须注意的？同一反应条件是不是主要指退火温度？除了退火温度和同一PCR仪跑之外，还需要注意什么一致性吗？取内参时是否直接打开正在运行的PCR仪快速取出而不中断反应？还是先停止后取出再重新设定后面剩下的5个cycle？
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chjipe 比较基因表达差异，我打算先做个半定量PCR大概看看有没有差异，如果有再继续跑real PCR。复习了理论和文献，细节如下：准备加GAPDH内参作参照，与目的蛋白分开两管跑，但反应条件保持一致（同一PCR机，GAPDH跑25个cycle后取出，目的基因跑30个cycle，GAPDH取出后目的基因继续跑完剩下5个cycle），退火温度按照目的基因摸的温度。然后同一块新鲜胶中跑电泳约45min后紫外验证拍照，目的基因与GAPDH加入同一泳道，取照片目的条带进行灰度分析，取不同泳道（细胞）的目的条带和GAPDH条带比值进行统计学分析，得出是否有差异。因为仅仅是计划，暂时停留在理论阶段，而且计划经常没有变化快。所以恳请高手帮忙看看有什么问题和细节必须注意的？同一反应条件是不是主要指退火温度？除了退火温度和同一PCR仪跑之外，还需要注意什么一致性吗？取内参时是否直接打开正在运行的PCR仪快速取出而不中断反应？还是先停止后取出再重新设定后面剩下的5个cycle？1、如果基因真的是有很明显的差异，而且在半定量的时候都可以区别开来，那20-25个循环足够了，跑太多了反而容易进入PCR的平台期从而削弱真实的差异。不过，从我做了那么多半定量的结果看来，和真实的荧光定量结果相比，所有的半定量结果都是渣，太多虚假和不确定的东西在里面了。只能作为参考用，不涉及实质。2、最好参照和目的基因同批跑，不过这样带来的一个问题是内参和目的基因的退火温度最好不要差太多，否则影响实际的效率。如果内参和目的基因非要分不同的循环，可以暂停PCR仪后迅速取出部分样品再继续。不过我觉得没这个必要。
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现在正在提取中，但氯仿反复抽提不知如何操作？另外，忽然想起从公司买的TE缓冲液不敢用，因为公司配好的肯定没有经过DEPC水处理的，就怕有RNA酶，难道还得自己用DEPC水来配？
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chjipe 现在正在提取中，但氯仿反复抽提不知如何操作？另外，忽然想起从公司买的TE缓冲液不敢用，因为公司配好的肯定没有经过DEPC水处理的，就怕有RNA酶，难道还得自己用DEPC水来配？1、同样体积的氯仿重复抽提上一步取出的上清液即可。2、最好是用DEPC处理过的TE缓冲液，自己配点不是很好。
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havocking 1、同样体积的氯仿重复抽提上一步取出的上清液即可。2、最好是用DEPC处理过的TE缓冲液，自己配点不是很好。收到！我这次因为没有预先准备好，不清楚步骤，不敢贸然行动，所以只能采用zhao战友的经验：“加入70%酒精后离心，然后弃上清，再离心，用20uL枪小心吸掉残液，然后晾大约10min钟，尽量干燥，再用DEPC水溶解”。结果还真不错，提了这么多次，第一次有样品提到1.95，其他3个均为1.80，看来此经验确实凑效。不过反想一下，如果再加上havocking战友的建议，估计几个样品应该都可以达到1.90以上了。下次联合两战友方法一起使用，争取做到更高更好！感谢两位！
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havocking 1、跑胶的结果未见明显的降解情况，带型也都很完整，建议下次用变性胶跑，缓冲液使用1xmops，也许带型会分的更加清楚些。样品的浓度在300ng-1000ng之间，排除你开始使用肿瘤细胞的总量偏少情况，这个浓度确实偏低些，但是不影响你反转的效果，一般反转试剂盒要求的总RNA量在500ng-5ug之间就可以了，个人习惯用3ug总RNA来反转。2、有两个样品在-80°保存一周后再测量浓度就只有之前的1/3了，这个绝对是有降解的情况发生，抽提好的RNA样品在-80°起码可以保存2个月，这个我做过实验，所以如果排除你测量的误差情况，你要改进下你抽提的步骤，以防RNA降解。3、未上样的5号孔也有条带，估计是你点样太多或是上样不小心，其它孔的样品漂到5号孔导致。4、OD值在1.5-1.9波动，这个波动范围太大了吧，建议你使用PH7.5的TE缓冲液做测量的稀释液而不要使用DEPC水，DEPC水呈现酸性，会导致你测量的比值偏低。很奇怪，我使用DEPC水做测量缓冲液，比值全部都是落在1.45-1.5之间，换TE缓冲液比值就在2.1-2.2之间，这个就和理论的预期很符合。我估计你测量的缓冲液是使用DEPC水，那这个比值也偏高了些，是不是有降解的情况发生呢？个人猜测。
您好，您习惯用3微克总RNA去做逆转录，那用的是多大的逆转录反应体系？
我用的是takara的反转录mix试剂盒，一个体系用用2微升的mix，加入RNA模板后，补至10微升的终体积，说明书上讲这样一个体系最多只能反转录500ng的总RNA。如果加大模板量，同时就要放大反应体系。
如果我也用3微克RNA去做逆转录（假设我能提到这么多的RNA，实际上有时提不到这么多），那就要60微升的体系，这样的量可以在一个管中完成吗？
另外，我想做十个基因的荧光定量，需要用多少量的RNA去做逆转录？
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zqm0815 编辑于
您好，您习惯用3微克总RNA去做逆转录，那用的是多大的逆转录反应体系？
我用的是takara的反转录mix，一个体系用用2微升的mix，加上RNA模板后，补至20微升的终体积，这样一个一倍的体系最多只能反转录500ng的总RNA。如果加大模板，同时就要放大反应体系。
如果我也用3微克RNA去做逆转录（假设我能提到这么多的RNA，实际上有时提不到这么多），那就要120微升的体系，这样的量可以在一个管中完成吗？
另外，我想做十个基因的荧光定量，需要用多少量的RNA去做逆转录？
谢谢！1、将你的RNA样品浓度提升至至少1ug/ul以上，这样足以保证20ul反转体系反转3-5ug的总RNA。2、一般20ul反转体系，反应完全后稀释十倍，每次qPCR取0.5ul做模版，自己算下够不够。
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havocking 1、将你的RNA样品浓度提升至至少1ug/ul以上，这样足以保证20ul反转体系反转3-5ug的总RNA。2、一般20ul反转体系，反应完全后稀释十倍，每次qPCR取0.5ul做模版，自己算下够不够。非常感谢！没想到您这么快就给了回复。
1，我下午记错了，我用的那个takara的逆转录mix试剂盒，一个一倍的反应体系是10微升。我下午可能是没有表述清楚，那个10微升的体系最多只能逆转录500ng的RNA量，多了就是浪费RNA。光是提高RNA浓度（就是在溶RNA的时候少加点水，对吧）应该也不行，只要RNA量扩大了，体系就要扩大。
另外，测RNA的OD值的时候，我是用1微升的RNA稀释成50微升，RNA浓度越高，浪费也越多。这就像是一个矛盾。
2，请问，反转录后，是稀释后保存，还是先保存，待到最终做qPCR时再一起稀释比较好？（我收临床标本，提RNA和逆转录是一个一个的做，做qPCR是一起做）
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zqm0815 非常感谢！没想到您这么快就给了回复。
1，我下午记错了，我用的那个takara的逆转录mix试剂盒，一个一倍的反应体系是10微升。我下午可能是没有表述清楚，那个10微升的体系最多只能逆转录500ng的RNA量，多了就是浪费RNA。光是提高RNA浓度（就是在溶RNA的时候少加点水，对吧）应该也不行，只要RNA量扩大了，体系就要扩大。
另外，测RNA的OD值的时候，我是用1微升的RNA稀释成50微升，RNA浓度越高，浪费也越多。这就像是一个矛盾。
2，请问，反转录后，是稀释后保存，还是先保存，待到最终做qPCR时再一起稀释比较好？（我收临床标本，提RNA和逆转录是一个一个的做，做qPCR是一起做）1、你确信没看错takara的逆转录mix试剂盒的说明，在我的印象中很多商业化试剂盒20ul的反转体系可以转录500ng-5ug的总RNA，你是不是将最低反转量看成最高了。如果takara试剂盒真这么不人性化，换个试剂盒么，比如精美的，比它还便宜，效果蛮好啊。不过就算takara试剂盒只能反转500ng总RNA，我觉得只要反转效果好，足够用于后续的qPCR检测。打个比方，如果起始的总RNA量相差10倍，在其它因素不变的情况下，低量的那份样品只需要多扩增3.32个循环，理论上效果就达到高量的那份样品，懂了吗？2、我一般同一个样品做两份转录，一份用于实验，另外一份-20度长期保存，以备不时之需！
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