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2.2不同时间点转染率的观察将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine 2000以2ug：5uL转染HSC-T6后，24 h即可见绿色荧光蛋白表达，48h绿色荧光蛋白表达最高，72 h则有所下降，48 h时转染率较24 h明显增高（29.22±1.14 vs 19.47±4.16 P＜0.05），与72 h比较无明显差异（29.22±1.14 vs 24.66±2.00 t=7.764，P=0.088）。2.3脂质体Lipofectamin 2000对细胞的毒性作用和G418筛选应用Lipofectamine 2000转染HSC-T6后镜下观察显示，在5uL的用量下，HSC-T6细胞未见明显细胞死亡表现。筛选结果显示：当细胞更换为含G418的培养基后，随G418浓度升高，时间延长，各孔均可见细胞死亡，6 d后，500ug/mL浓度以上细胞全部死亡，筛选15 d后，细胞全部死亡最低浓度为300ug/mL。2.4阳性克隆的筛选pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine 2000比例为2u：5uL转染HSC-T6 4 h，改用含400ug/mlG418培养基，15%FCS的DMEM培养液2 mL，6 d后细胞大部分死亡，G418浓度减至200ug/mL维持筛选，残存细胞约14d后形成阳性克隆（图1）。3讨论基因转染技术在生物学研究领域和临床应用都已取得了很大的进展。目前使用的基因传递载体有病毒载体和非病毒载体两类[1]。阳离子脂质体作为非病毒载体，在基因转染中得到广泛应用[2-3]。HSC作为肝纤维化发病的关键环节倍受关注，以HSC为靶标的治疗措施逐渐成为抗纤维化的重要方法[4]。较多实验通过基因转染的方法，体外研究HSC激活机制或抗纤维化机制的研究，但其转染条件及方法仍需进一步研究。本实验运用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将pcDNA3.1(+)-EGFP质粒转染HSC，24 h后可见绿色荧光蛋白表达情况，说明Lipofectamine 2000可成功转染HSC-T6。国外研究已证实，脂质体的转染率除外与阳离子脂质体的构型有关外，还与阳离子脂质体与DNA的比例，脂质体复合物的结构，脂质体复合物的剂量等有关[5-6]。脂质体/DNA复合体的大小和形状受阳离子脂质体和DNA的摩尔比影响，脂质体与DNA的电荷比在１∶１时，则有明显的大小及结构的改变，形成的复合体的粒径最大，在体内的半衰期延长，基因转染效率最高[7-8]。我们将质粒与不同剂量脂质体混合转染HSC-T6，当质粒与Lipofectamine 2000比例为2ug：5uL时，转染率最高，同时，观察转染24、48及72 h后绿色荧光蛋白的表达，发现随着时间延长，转染率有所增高，48 h转染率最高，72 h后绿色荧光蛋白的表达有所下降。基于本研究，推测质粒与Lipofectamine 2000比例为2ug：5uL时，脂质体与DNA电荷比接近1：1，可获得最佳转染率，但随着时间的延长至72 h，绿色荧光蛋白的表达会有所下降，目的基因不能得到稳定的表达。为了目的基因得到稳定表达，可根据质粒上带有的耐药基因而选择相应药物进行筛选，建立稳定转染细胞株，目前最常用的方法是G418筛选。HSC-T6细胞系经G418筛选15 d后，细胞全部死亡最低浓度为300ug/mL，确定筛选浓度为400ug/mL，维持筛选浓度为200ug/mL。将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamin 2000比例为2u：5uL转染HSC-T6 4 h后，通过G418筛选，约20 d后可形成阳性克隆，并可正常培养和传代。本研究证实：Lipofectamine 2000可高效转染大鼠肝星状细胞系HSC-T6，当质粒与脂质体比例为2ug：5uL可获得最高转染率，G418筛选可获得基因稳定表达的细胞克隆，本实验为运用该细胞系进行基因转染方面的研究，尤其是运用稳定表达目的基因的细胞系开展肝脏疾病，特别是肝纤维化方面的研究奠定基础。[教育期刊网 参考文献][1]Weiwei Wang,Wenzhong Li,Nan Ma,et al.Non-Viral Gene DeliveryMethods[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2013（14）:46-60.[2]Kai K Ewert,Alexandra Zidovska,Ayesha Ahmad,et al.Cationic Liposome-Nucleic Acid Complexes for Gene Delivery and Silencing:Pathways and Mechanisms for Plasmid DNA and siRNA[J].Top Curr Chem，-226.[3]Caracciolo G,Amenitsch H.Cationic liposome.DNA complexes:from structure to interactions with cellular menmbranes[J].Eur Biophys J,):815-829.[4]Kang JH,Toita R,Murata M.Liver cell-targeted delivery of therapeutic molecules[J].Crit Rev Biotechnol,2014（15）:1-12.[5]Chen JL, Wang H, Gao JQ, et al. Liposomes modified with polycation used for gene delivery: preparation, characterization and transfection in vitro[J].Int J Pharm,-2):255-261.[6]Obata Y,Ciofani G,Raffa V,et al.Evaluation of cationic liposomes composed of an amino acid-based lipid for neuronal transfection[J].Nanomedicine, ):70-77.[7]Majeti BK, Karmali PP, Reddy BS, et al.In vitro gene transfer efficacies of N,N-dialkylpyrrolidinium chlorides:a structure-activity investigation[J].J Med Chem,):.
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&本站推荐的论文　　Invitrogen供稿&&& PureLink&#8482; HQ Mini质粒纯化试剂盒特别为从多种类型的细菌菌株中快速、高效地纯化可用于转染的高纯度质粒DNA而设计，每次纯化最高可得到60微克的高纯度质粒DNA！纯化的质粒质量高、产率稳定可靠、可重复性好，完全适用于各种下游操作，如：酶切、自动荧光测序、Gateway克隆、转化细菌DD特别值得注意的是可用于转染哺乳动物细胞。&&& 传统的碱裂解法提取细菌质粒，首先用含有RNAse的溶液悬浮细胞；加入含有去垢剂的碱裂解液来裂解细菌，同时也使DNA变性；再加入用于中和的缓冲液（通常是醋酸钾缓冲液）使高分子的蛋白和基因组DNA沉淀下来；这样就可以通过离心或过滤的方法轻易地去除这些杂质；而环状的质粒DNA经过中和后复性，成为可溶状态而留在上清溶液中；最后往往借助异丙醇沉淀从溶液中分离出质粒DNA。现在，基于硅介质技术的纯化系统日渐流行，主要是因为这种技术就能得到质量和纯度足以满足大多数的分子生物学应用需要的质粒，而价格比起阴离子交换柱更加便宜，操作更加快速方便。在较高浓度的离液盐（chaotropic salts）环境下，溶解于溶液中的质粒DNA能结合于硅树脂上，然后可以用低盐缓冲液或水将质粒DNA洗脱下来。但是常规的这种快速纯化方法不适宜用于纯化大拷贝质粒，而且得到的质粒通常不宜用于转染。&&& PureLink&#8482; HQ Mini Plasmid DNA Purication Kit所采用的也是基于硅介质技术的离心纯化柱，而纯化得到的质粒DNA不单可以用于如酶切、PCR、测序、细菌转化等用途，更可以用于哺乳动物细胞的转染。而特别值得注意的是，这个试剂盒的操作方法非常简单DD同样是基于碱/SDS裂解法，改良的玻璃微纤维柱专一结合质粒DNA，经过洗涤纯化柱去除基因组DNA或者RNA的污染，最后用低盐溶液洗脱。&高达60微克的大容量&&&&分别从1.5, 3, 6, 9x109个大肠杆菌细胞中提取质粒DNA（pcDNA3.1/CAT）。其中PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒纯化程序是分别裂解1.5x109的细菌，将离心得到的上清液合并上柱从而得到相应的细胞数。最后都是用100微升洗脱缓冲液一次洗脱。&&& 常规的”mini”质粒纯化试剂盒在开始的1.5x109 的细菌质粒纯化时表现与HQ相当，当增加细胞的量时，比如到9x109个大肠杆菌细胞时，常规的mini纯化柱很快的超 “负荷”到达纯化柱的载量极限，而采用PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒则可以得到超过60微克的质粒，产量比常规试剂盒平均提高35％。纯化大型质粒&&& 常规的硅胶膜技术并不适宜提取较大的质粒，洗脱得率很低。采用PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒从1ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取40kb大小的p5L393质粒，也可以得到3-7ug/ml的产率，OD260/280比值在1.86±0.07左右。在标准条件下限制性内切酶可以完全酶切质粒并得到所需的条带，而且目测不到基因组DNA或者RNA的污染(&5%)。&质粒酶切电泳图泳道1：p5L393/HindⅢ泳道2：p5L393/AvaⅠ泳道3：p1Kbplus/BamHⅠ泳道4：1Kb Plus DNA ladder泳道5：1 Kb DNA Extension Ladder转染哺乳动物细胞&&& 转染，是在哺乳动物细胞中导入外源基因并进行表达和研究的重要手段。转染成功的关键要素之一在于质粒DNA的质量DD超螺旋DNA的比率、RNA污染、内毒素等等。采用PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒纯化的质粒能够稳定高效地转染多种细胞株，见下图：&&& 特别值得一提的是，PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒纯化得到的质粒其内毒素含量明显低于已知文献中用硅胶填料纯化所得质粒的内毒素水平（Qiagen, Product Guide 2003, p. 119-120），实际上，PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒纯化得到的质粒其内毒素水平仅仅略高于用离子交换方法纯化的质粒样品，同样达到转染标准，但是操作就简单快速多了。根据文献（Fox et al., BioTechniques, 0C619）所载，对于多数常用的细胞株来说，DNA中的内毒素水平超过2000 EU/&g时会显著抑制转染。&酵母质粒的纯化&&&&酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的常用工具。在筛选后的一个通用步骤是通过“再转化”来确证筛选得到的阳性克隆DD就是从阳性克隆的酵母菌株中提取质粒DNA，转化大肠杆菌，找到带有“猎物”的质粒DNA，并分析其DNA序列。&&& 我们用PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒成功在酵母细胞中提取高质量的质粒DNA。只需要先用专门消化真菌细胞壁的zymolyase酶消化酵母细胞壁，再用PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒标准步骤就可以从酵母中提取高质量的质粒DNA。整个过程简单、迅速，可重复性高，并可以用于常规提取酵母低拷贝(ARS/CEN-based)和多拷贝(2u-based)的质粒，提取的质粒可以用于PCR和细菌转化等操作。不惧低拷贝&&&在土壤杆菌介导的植物转化中用到的载体通常都是低拷贝的。在转染植物之前，通常会用A. tumafaciens细胞来筛选质粒。对HQ kit进行一些改动（增大中和/结合缓冲液体系，加入35％盐酸胍，40％异丙醇，50μl连续洗两次）就可以快速、高效、可重复地提取这种低拷贝的质粒，比如：14kb大小的pBⅠ121质粒。提取的质粒可以用于酶切分析和大肠杆菌的转化。&&&& 从上述介绍我们可以看出，PureLink&#8482; HQ Mini试剂盒的优点在于* 可以从多种细菌和酵母中快速、高效纯化各种高拷贝或者低拷贝的质粒，得到高质量的质粒DNA* 超高柱载量可以让你一次收获更多的质粒* 极低的基因组DNA和RNA污染保证高纯度质粒DNA* 可以纯化高达40kb的大型质粒* 纯化的质粒DNA可用于各种常规下游应用，如酶切、细菌转化、自动荧光测序、Gateway克隆、体外转录和体外翻译* 纯化的质粒内毒素低，超螺旋比率高DD可稳定高效转染多数常用的哺乳动物细胞株
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[求助]LIPOFECTAMINE 2000转染问题若干
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[求助]LIPOFECTAMINE 2000转染问题若干
LIPOFECTAMINE 2000应该是比较公认的好的转染试剂，周围很多人都在用。我是第一次用。
当然，在用之前，我就咨询了实验室里的师兄师姐和师妹。综合前人的经验如下：
1. 细胞铺板后24小时左右开始转染（理由：这是细胞已经贴壁，且处在增殖期，有利于外源DNA的表达，而且，说明书上也是建议转染前24小时铺板）。
2.接种细胞的密度尽量高一点（理由：这样可以得到高的转染效率）。
3.转染后4~6小时换培养基（理由：LIPOFECTAMINE 2000对细胞有毒性）。
4.体系中的所有成分减半，包括：每孔培养液的体积，DNA和LIPOFECTAMINE 2000的量。但是，最终每孔中DNA和LIPOFECTAMINE 2000的浓度和说明书上推荐的是一致的。（理由：这样可以节省资源）
第一次做，我严格按照说明说的要求，并按照前人的经验。但是现在看来还是出问题了：
铺板24小时后，293细胞基本都贴壁了，但是状态不佳——本来应该有突起的细胞，还没有长突起。但是我还是硬着头皮做了转染，同时做了两空对照——一个是没有加DNA和LIPOFECTAMINE 2000，但是加了用来稀释DNA和LIPOFECTAMINE 2000的OPTI-MEM;一个是只加了LIPOFECTAMINE 2000，没有加DNA。
6小时后，所有孔，我都换了新鲜的培养基。
现在48小时过去了，第一个对照孔（没有加DNA和LIPOFECTAMINE 2000），细胞长的很好；第二个对照孔（只加了LIPOFECTAMINE 2000，没有加DNA），细胞状态差点；其他同时加DNA和LIPOFECTAMINE 2000的，细胞状态极差，有很多细胞都飘起来了。
以上的结果可以证明LIPOFECTAMINE 2000是有细胞毒性的——而不是向invitrogen宣传的那样。对我这样的实验结果，我的思考如下：
1.因为铺板24小时后，细胞状态还不是很好，是否可以考虑，等到细胞状态很好时再转染？
2.这次转染的细胞，我继续培养，如果三天后，转染的细胞长起来了，我是否可以继续往后做（比如做WB检测）？但是，转染后这么长时间，转进去的质粒会不会被细胞内的核酸酶破坏掉了？ 其表达的蛋白会不会也被破坏了？
3.有没有必要专门做个实验，来摸索LIPOFECTAMINE 2000和DNA的量？
4.大家能否给点建议？多谢！
顺祝群友们龙年快乐，实验顺利！
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不一定要铺板后24小时转染,转染时机的标准应该是细胞丰度适中和状态佳. 铺板后三天转染都没有问题的.
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我不同意&铺板后三天转染都没有问题&
总体来说,细胞长三天后转染,对转染效率会有影响的,因为细胞状态不如小于48小时的状态好.
接种密度要合适,不能过稀;
lip2000的毒性不是很大,大多时候是我们转入的载体影响细胞的正常生长;这有时与载体的纯化质量有关,也与转染的载体量有关.
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个人认为lip2000的毒性比较大，转染后细胞状态不好与此有很大关系。
可尝试将lip2000量减低。用EGFP转，摸个最低用量。
说明书推荐的剂量一般都是比较大的，你用得多，公司才卖得多，才赚得多，所以没必要花冤枉钱。只要用的量够把足够多质粒转进去就可以了。
质粒就不必吝啬了吧，和lip2000相比，成本相去甚远。
等细胞状态好的时候种板，而不是种板后再等细胞状态改善。一定要保证每次实验处于同等条件，这样你的实验才有重复性。
种板后24h内转染是最合适的，长点问题也不大，但个人认为不要超过48h，毕竟贴壁生长不同时间的细胞状态是不一样的，必须要保证实验的可重复性。
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我刚做的转染,(做RNA干扰,用质粒作为载体,三条针对目的基因,一条无关序列)和楼主说的问题是一样的,我做了(只加了LIPOFECTAMINE 2000，没有加DNA)对照,细胞一直长的很好,其它四组加了载体的细胞状态极差,24小时后细胞死亡一半,到第4天细胞所剩无几了,个人认为载体影响比lip2000对细胞影响更大,现在正在减少载体的量摸索实验条件,明日观察结果!
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现在的LIPOFECTAMINE 2000可以在有血清状态在转染了,大家试过么?怎么样?
我刚刚作了,后天出结果告诉大家
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lipo2000还是挺毒的，如果用量在10ul以上对细胞的毒性就很明显了。
我一般4h左右就要换液，细胞就不会浮起来，转染效率也不低。
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给大家汇报下结果
前天提蛋白，昨天跑WB，今天显色。发现我的转染的细胞，目的蛋白表达了，量还比较大。对照组，没有一点信号。
看样子这样做是可以转的。因为这是第一次做，也算是摸条件。
我准备下次做的时候，细胞铺板密度提高一倍，铺板后40小时转染，然后lipo2000的量稍减一点——六孔板，每孔4ul。质粒每孔2ug。我想这样不会有什么问题了。呵呵
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回复 #8 白白的 的帖子
4.体系中的所有成分减半，包括：每孔培养液的体积，DNA和LIPOFECTAMINE 2000的量。但是，最终每孔中DNA和LIPOFECTAMINE 2000的浓度和说明书上推荐的是一致的。（理由：这样可以节省资源）
浓度是一致的，可是质粒的绝对数量是减半的啊，这样是不是也可能降低转染效率呢？
你有没有预转染过荧光蛋白质粒 ，这样可以较为方便的判断转染 成功与否及其转染效率呢？
大家有用LIPOFECTAMINE 2000转染2215细胞的吗 ？转染效率最高能达到多少啊？最近刚做了两次预转染，结果不是特别理想！
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汇报结果：
用LIPOFECTAMINE 2000有血清状态下转染293T细胞，不换液，48H后收集细胞，准备做WB。用GFP做效率对比，，感觉不错（见图），约60%-70%被转染成功。
心得体会：
1、LIPOFECTAMINE 2000现在可以在有血清的状态下转染，省力。
2、质粒用量不能按说明上来，eg,10UL的LIPOFECTAMINE 2000加4UG的质粒根本达不到效果，至少要6－8UG质粒才可保证明显的结果（因为我的蛋白分子量大，约250KD）。
3、视细胞死亡情况看换液与否。我与技术支持联系过，他们说每一个批号的LIPOFECTAMINE 2000毒性有差别，要视情况而定是否换液。1.武汉大学基础医学院& 武汉& .咸宁职业教育集团学校& 咸宁& 437100
摘要：目的：探讨带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的pEGFP.N3是否能够有效转染ADSCs。方法：提取pEGFP-Genesil-1质粒，采用Lipofectamine2000脂质体将绿色荧光表达质粒Genesil-1载体转染至ADSCs。镜检各个时间点含有荧光的鼻咽癌细胞数，并选取转染率最高时间点的鼻咽癌细胞，用流式检测精确的转染率。结果脂质体复合物转化ADSCs 24h后，荧光倒置显微镜下可见绿色荧光，4ug/ml质粒浓度组转染48小时绿色荧光蛋白阳性细胞率达最高值。结论 带有增强型绿色荧光蛋白基因的pEGFP.N3可以较为高效地转染ADSCs。
关键词：EGFP；ADSCs 鼻咽癌细胞；绿色荧光表达质粒
&&&&&&& 脂肪来源干细胞（ADSCs）因其来源充足、易于扩增、可多向分化等特点而成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点。在体内实验中，为证明移植细胞的转归和生成组织的来源，细胞的标记与示踪是关键问题之一。本实验用带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的pEGFP．N3转染ADSCs，检测其转染效率及体内移植效果，为ADSC的研究和应用奠定基础。
&&&&&&& 1.材料与方法
&&&&&&& 采用Lipofectamine 2000脂质体将绿色荧光表达质粒Genesil-1载体转染ADSCs，分别收集各细胞样品进行流式细胞检测转染率和在光学显微镜下观察细胞形态。各个时间点转染的鼻咽癌细胞，在荧光显微镜下随机取不重复视野，每个视野数100个细胞，计数荧光细胞数，每时间点计数三次，取平均值，各时间点的转染率，，送转染率最高的时间点的鼻咽癌细胞再做流式检测精确的转染率。实验数据用x&s表示，利用SPSS12统计软件处理，两受体表达在两细胞中比较采用t检验，p0.05为差异有统计学意义。所得实验数据以X&s 表示，使用 SPSS20.运用配对t检验统计学分析， P&0.05被认为有统计学意义。
&&&&&&& 2.结& 果
&&&&&&& pEGFP-Genesil-1质粒．脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24h后，大量细胞表达绿色荧光蛋白，荧光倒置显微镜下可见绿色荧光，绿色荧光蛋白阳性细胞率达（13.0+3.5）％。在转染后48小时以前，随培养时间的延长，绿色荧光蛋白阳性细胞率逐渐增加，无论哪个浓度组，转染48小时绿色荧光蛋白阳性细胞率达最高，随后渐渐下降。在荧光显微镜下计算转染率和流式细胞检测转染率。结果显示：每一个质粒浓度组转染ADSC后，转染率渐渐增加，转染后48小时转染率达最高，随后又渐渐回落，软件分析结果显示：4 ug/ml质粒浓度组门内SSC轴坐标值代表了荧光细胞的百分比即为转染率57.45%，而2仅为0.9%。
&&&&&&& 3.讨&& 论
&&&&&&& 在脂肪来源干细胞研究中，对于移植细胞的有效标记和示踪是研究所涉及的重点之一。常用的细胞标记方法很多，包括BrdU标记、DiI标记、DAPI标记、PK26标记、Hoechst3 8标记、报告基因转染标记法、同位素标记法等。化双重染色，但当细胞发生凋亡或死亡时，BrdU则可掺入到其它细每种标记法都有其各自特点[17-19]：BrdU标记法可采用Brdu+免疫组胞，难以区分移植细胞和宿主细胞；荧光染料标记法方法简便，不足之处是随着细胞的分裂标记物也几乎等份地分配给两个子细胞，子细胞的荧光强度也随之下降；Y染色体标记法技术简单，标记效率及稳定性都很高，存在的问题是，易出现假阴性结果及不能用于自体细胞移植的研究；同位素标记法因存在放射性污染等不足已逐渐少用；报告基因转染法标记可长期体内标记，但存在转染率低等问题。
&&&&&&& 绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括 水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。GFP作为标记物时不需加任何底物，可直接用长波长紫外光照射观察。其分子量较小，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能影响小，大量表达对细胞也无毒性作用，细胞仍可连续传代培养。绿色荧光蛋白荧光表达稳定，可耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质，并且无光漂白现象。
&&&&&&& 目前常用的基因转染载体有病毒载体和质粒载体。脂质体介导的质粒转染法是近年来开始广泛使用的一种方法，通过本实验可看出，在质粒转染初期，转染率相对较低，以含G4 1 8的培养液连续传代后，G4l 8抗性细胞即GFP阳性表达细胞逐渐增多。在G4 l 8杀伤细胞浓度测定实验中可以杀死全部细胞的浓度在筛选中并未达到未转染细胞全部死亡的效果，分析其原因可能是质粒转染的细胞在细胞分裂过程中发生质粒丢失，随之又出现G4 l 8抗性非表达细胞，但随着筛选时间的延长，抗性细胞逐渐增多，即GFP阳性细胞逐渐增多，在第5代时可达60．70％。
参考文献：
[1]Zhao DC，Lei JX，Chen R，et al．Bonemarrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rats． WOrld J Gastroenterol， 2005． 1l：343-3440．
[2]DingWM，Bai JZ，Zhang JM，etal．In vivo tracking of implanted stem cells using radio-labeled transferring scintigraphy，Nucl Med Biol，9-725．
[3]Vogel G．Harnessing the power of stem cells[J]．Science，（5407）：．
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