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野生大豆核基因组mb级dna的制备与酶切
preparing and digesting megabase-size nucle.
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preparing and digesting megabase-size nuclear dna of glycine soja genome
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野生大豆核基因组mb级dna的制备与酶切
preparing and
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DNA的限制性核酸内切酶酶切实验和连接实验
来源:生物谷
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一）酶切实验　　本实验学习用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）EcoRI 切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。 　　【原理】 　　λDNA 是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA中 G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDNA切成6个大小不同的片断。pBR322 DNA为人工构建的质粒DNA, 分子大小为4.3 kb，含有1个EcoR I酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。　　【材料】 　　1．λDNA(0.1ug/ul)，pBR322 DNA（0.25 ug/ul） 　　2．限制性内切酶EcoRI 　　3．EcoRI 酶切缓冲液（Buffer solution 10×） 　　4．去离子水 　　5．电泳及染色用材料 　　【方法】　　1．取洁净EP管2只，按表10－1加入各成分。　　2．混匀，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。　　（二）DNA连接实验　　T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3@羟基和5@磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA 连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA 　　【材料】 　　1．λDNAEcoRI酶切片段　　2．T4 DNA连接酶 　　3．T4 DNA连接酶缓冲液（10×） 　　4．去离子水 　　【方法】 　　1．取洁净EP管1只，分别加入：　　①去离子水 7ul,　　②T4 DNA连接酶缓冲液（10×） 2 ul，　　③λDNA酶切片段（已65℃10分钟灭活）10ul　　④T4 DNA连接酶1ul　　2．混匀后，放13℃水浴过夜，待电泳检测。
关于生物在线
联系人：生物在线编辑部
电话：021-
传真：021-宏基因组文库构建
宏基因组文库构建分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养(1)，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。“宏基因组（Metagenome）”是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“thegenomesofthetotalmicoiotafoundinnatue”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（2）。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等（3、4、5）。一、实验原理1、基本原理从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选,或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。2、载体促使宏基因或基因簇在重组克隆子中表达或提高表达量，载体起着重要作用。载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目标产物基因的表达、目标基因的扩增及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。1）大片段插入载体由于很多微生物活性物质是其次生代谢产物，代谢途径由多基因簇调控，尽量插入大片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的。目前多采用细菌人工染色体(BAC)和粘粒（Cosmid）载体，前者插入片段大（可达350k），但克隆效率低，后者插入片段中等（20k—40k），克隆效率高。RodonM.R.等和1
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本文标题：宏基因组文库构建 链接地址：
copyright@ 2013- Inc. All Rights Reserved 果果文库 版权所有 联系站长: ; 经营许可证编号:浙ICP备号第九章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
第一节 基因组DNA文库的构建
基因组DNA文库：指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。
代表性和随机性
代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。在文库的构建过程中引用了两个策略，一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；二是提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：
N=ln（1-p）/ln（1-f）
N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数
p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率
f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值
一、载体的选择
构建大片段基因组DNA文库使用的载体主要有λ噬菌体（λ phage）、粘粒载体（cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial
Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染色体YAC（Yeast artificial chromosomes,YACs）、P1（Bacteriophage P1）和PAC。根据特征，这些载体可以分为两类，一类是基于噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点；另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源片段。
二、基因组DNA文库的构建流程
基因组DNA文库的构建流程相对简单，但其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备，尤其是构建插入片段较大的文库如PAC、BAC和YAC文库，其成功的关键都体现在操作的细节上。基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：①载体的制备；②高纯度大分子量基因组DNA（High molecular
weight DNA,& HMW DNA）的提取；③HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size
selection）；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。图8-1为构建BAC文库的基本程序，这一程序同样适合Cosmid文库、PAC文库和YAC文库的构建。构建噬菌体文库如P1等的程序稍有不同，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。
1．基因组DNA文库的载体制备
载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。
2．高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切
构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。
3．文库的连接转化或包装侵染
一般在构建大片段基因组DNA文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的感受态细胞和最佳的转化条件或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。
4．文库的质量检测
在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。文库的平均插入片段长度是通过PFGE电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对BAC文库，一般要求植物的在130kb左右，而动物的在150kb左右。插入效率也是通过此法检测的，表示有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程，一是计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是约数）；另一种算法是结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值。
三、重组体的筛选和分析（见本章第三节）。
四、亚基因组文库的构建
第二节cDNA文库的构建
cDNA文库中的外源DNA片段是互补DNA（complementary DNA,
cDNA）。cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA。cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建共分四步（图8-2）：
第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离；
第二，第一链cDNA合成；
第三，第二链cDNA合成；
第四，双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
一、RNA的分离
cDNA文库构建是以mRNA为起始材料的，mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化mRNA的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]链，由它与mRNA的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。
1．mRNA的完整性
指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA的大小，总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力。
2．mRNA的丰度
高丰度mRNA：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90%。
低丰度mRNA：含量&0.5%被称为低丰度或稀有mRNA。
3．mRNA的富集
3.1 按大小对mRNA进行分级分离
3.2& cDNA的分级分离
近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA，agarose分离大小易辨。
3.3 多聚核糖体的免疫学纯化法
用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体。
免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱：单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo（dT）层析分离mRNA。此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%。并非都可用，根据材料\来源\特异性来选择。
二、cDNA第一链的合成
由mRNA到cDNA的过程称为反转录，是由反转录酶（reverse
transcriptase）催化的。常用的反转录酶有两种，即AMV（来自禽成髓细胞瘤病毒）和MMLV（来自Moloey鼠白血病病毒），二者都是依赖于RNA的DNA聚合酶，有5’ --3’ DNA聚合酶活性。合成DNA时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即Oligo（dT）和随机引物。Oligo（dT）引物一般包含10～20个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含6～10个碱基的寡核苷酸短片段。
Oligo（dT）引导的cDNA合成是在cDNA的合成过程中加入高浓度的Oligo（dT）引物，Oligo（dT）引物与mRNA的3’ 末端的poly（A）配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于cDNA末端存在较长的poly（A）而影响cDNA测序。
随机引物引导的cDNA合成是采用6－10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的5’ -端序列。随机引物cDNA合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于克隆特定mRNA的5’ 末端，如RT-PCR和5’ -RACE。
三、cDNA第二链的合成
即将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。
1．自身引导法（图8-3）：
首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链，解离的第一链cDNA的3’ -末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关），并引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。
2．置换合成法（图8-4）：
它是由一组酶共同控制，包括RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶。mRNA－cDNA杂合双链中的mRNA链在RNA酶H作用下先形成很多切口，mRNA链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ提供了合成第二链的引物。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ以第一链cDNA为模板合成一段段互补的cDNA片段。这些cDNA片段进而在DNA连接酶的作用下连接成一条链，即cDNA的第二链。遗留在5’ -末端的一段很小的mRNA也被大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5’
核酸外切酶和RNA酶H降解，暴露出与第一链cDNA对应的3’ -端部分序列。同时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的3’
--5’ 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA的3’ -端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这种方法合成的cDNA在5’ -端存在几个核苷酸缺失，但一般不影响编码区的完整。
3．引导合成法（图8-5）
本方法是Okayama和Berg（1982）提出的。首先是制备一端带有Poly（dG）的片段Ⅱ和带有Poly（dT）的载体片段Ⅰ，并用片段Ⅰ来代替Oligo（dT）进行cDNA第一链的合成，在第一链cDNA合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3’ -端加上一段Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段Ⅱ一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA。其主要特点是合成全长cDNA的比例较高，但操作比较复杂，形成的cDNA克隆中都带有一段Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。
4．引物－衔接头合成法是Gubler和Hoffman（1983）通过改进引导合成法而来的。第一链合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3’ -端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的cDNA链，接头序列可以是适用于PCR扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列。这一方法目前已经发展成PCR法构建cDNA文库的常用方法。
四、双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖。
双链cDNA在和载体连接之前，要经过一系列处理，如同聚物加尾、加接头和分级分离。
1．同聚物加尾（图8-6）
该方法只对质粒有效，尾的长短不一（100dA/dT,20dG/dC）。同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E. coli的效率随宿主不同而不同。
2．合成接头和衔接头（图8-7）
平端连接的效率低，加尾和加接头主要为了提高连接效率，其中添加带酶切位点的接头最为常用的方法。一种方式是单酶切位点连接策略，其在第一链合成时不引入接头，而直接在第二链上通过平端连接导入接头，当导入的粘端接头已经去磷酸化，则可以分级分离后直接用于连接；当导入的粘端接头带有活性磷酸基团时，所加接头需选择甲基化敏感的酶且加接头之前必须对双链cDNA进行甲基化处理，加上接头后再用该酶进行消化，创造用于连接的粘端。另一种方式是双酶切连接的策略，一般在第一链合成时在cDNA的5’ -端引入一稀有酶切位点，如NotⅠ，在双链cDNA平端连接上带去磷酸化粘端的接头，如SalⅠ，然后用NotⅠ酶切创造出另一端的粘端，这样可以与对应双酶切载体连接。同时，双酶切连接可以对插入的cDNA具有定向的作用。
3．其他方法
3.1& mRNA-cDNA杂交体克隆
合成第一链后,通过末端转移酶加尾，然后与带dT尾的载体退火，在宿主体内，可除去RNA，代之以DNA。此方法无须合成第二链，且序列完整，但效率低。
3.2 经典RACE
cDNA克隆时常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆。cDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法获得3’ 末端和5’ 末端的序列。工作原理见图8-8、图8-9。筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆，而RACE可产生大量独立克隆。引物GSP1根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计。
3.3 新RACE
五、cDNA克隆用的载体（见第三章）。
第三节 基因克隆的筛选策略
一般来说，这一筛选过程的难易程度，主要取决于所采用基因的克隆方案和目的基因的性质与来源。从文库中筛选目的基因的方法主要有以下几种：核酸杂交法，免疫学检测法。
一、表型筛选法
对于生物的遗传来说，基因型决定表现型，也就是说，生物体的表型特征是由控制其性状的基因编码的。因此，可以通过观察表型的变化来筛选目的基因。表型筛选法就是根据目的基因编码比较特殊的功能，并且其与载体作用可以在宿主菌（如大肠杆菌）中表达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表形性状来，这样就很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。这种表型特征一般要求是直接的形态学特征或比较容易检测的生化酶学的特征，比如营养缺陷型相关的基因和抗性基因（类似抗逆性基因）等。对于表型筛选法来说，其对所使用的宿主有相应的要求，宿主为不携带该种基因或是该基因的缺失突变体。
二、杂交筛选和PCR筛选
当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表达的真核生物的基因，可以利用的可能只是该基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白质产物，此时就必须考虑其它的方法来筛选。杂交筛选法是应用最为广泛的筛选目标基因克隆的一种方法。
用已知序列的基因的筛选保存于384孔培养板的大片段DNA文库时，还可以采用更加简单快捷的方法——混合池PCR筛选法。一旦混合池构建好以后，PCR筛选将非常方便，每天可以做大量的PCR反应，筛选大量的标记。PCR筛选法还有一个很大的优点是可用SSR引物从文库中筛选阳性克隆，而核酸杂交法却不能以SSR序列为探针筛选阳性克隆。
三、免疫筛选
免疫筛选法和核酸杂交的方法类似，只是其使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体。适合免疫杂交法筛选的外源基因首先要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的DNA文库必须是表达文库，通常是原核生物的基因组DNA文库和真核生物的cDNA表达文库。而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因。
四、高表达基因
复习思考题：
1、基因组DNA文库有哪些类型？特点是什么？
2、构建大片段基因组文库要注意哪些问题？
3、均一化DNA文库构建的基因原理是什么？
4、扣除DNA文库构建的原理是什么？主要用途是什么？
5、全长cDNA文库构建的原理和基本类型是什么？
6、基因克隆筛选的几种方法和相关技术特征是有哪些？
本章小结：
基因文库指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为：基因组DNA文库（genomic DNA
library）和cDNA文库（complementary DNA library）。基因文库构建的基本程序包括：1、提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；2、DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；3、重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。cDNA第二条链的合成在cDNA文库的构建中非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引导合成法，引物－衔接头合成法可以合成cDNA第二条链。文库构建以后可以通过表型筛选法、杂交筛选和PCR筛选、免疫筛选法筛选目标基因。