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基因工程基础知识
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基因工程的概念
第一篇:基因工程的概念生 物 技 术 专 业 课 程
1 基因工程的基本概念 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因工程的操作过程 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 6 大肠杆菌基因工程 7 酵母基因工程 8 哺乳动物基因工程
9 高等植物基因工程
1 基因工程的基本概念
1. 1 重组DNA技术的基本定义 1. 2 基因工程的基本定义 1. 3 重组DNA技术与基因工程的基本用途 1. 4 基因工程实验方法及步骤 1. 5 基因工程的基本形式
1 基因工程的基本概念
1. 1 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与
载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受
体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物
或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基
1 基因工程的基本概念
1. 2 基因工程的基本定义
广义的基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与
应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技
术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组
DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的
大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
狭义的基因工程的定义:
在分子水平上，提取（或合成）不同生物的 遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重 组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内， 使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制 与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同 的产物或定向创造生物的新性状，并能稳定遗传 给下代。基因工程又名遗传工程（genetic engineering ）DNA重组（recombinant DNA technique）分子克隆（molecular cloning）基 因克隆（gene cloning） 基因工程的核心包括基因克隆和基因表达。
目的基因的获得 （PCR技术）
连接到表达载体形 成重组DNA分子
转化到动物、 植物及微生 物（大肠杆 菌）或其它 表达系统 筛选重组 克隆，培 育个体，
蛋白质的提取 纯化及功能鉴 定
鉴定动物 及植物优 良性状
1.2.1基因工程主要技术：
1. 从细胞和组织中分离DNA。2. 利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restriction
endonucleases)酶切DNA分子，或PCR方法制备基因片段。
3. 将酶切的基因片段与载体DNA连接，构建重组DNA分子。4. 将载体与基因片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞后，该重组DNA分 子能在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆(clones)。5. 重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具 有重组DNA分子的拷贝。6. 能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子。
7. 克隆的基因能转录成mRNA、翻译成蛋白质。能分离、鉴定基因产物。
1.2.2 基因工程的开端
日，英 国《自然》杂志发表 了沃森和克立克的文 章“核酸的分子结 构 ― DNA的一个结 构模型”。标志着 DNA双螺旋结构的建 立，从此，遗传学和 生物学的历史从细胞 阶段进入了分子阶段。
J D Watson
F H C Crick
桑格（英国化学家） 最早测定胰岛素的氨 基酸顺序获得1958年 诺贝尔化奖。22年后， 他因测定了一种噬菌 体的一级结构获1980 年的诺贝尔化学奖。吉尔伯特在DNA测 序领域，因其卓越的 工作获得1980年诺贝 尔化学奖。
伯格（美国生物化学家） 通过把两个不同来源的 DNA连结在一起并发挥其 应有的生物学功能，证明 了完全可以在体外对基因 进行操作。他作为“重组 DNA技术之父”于1980年 获诺贝尔化奖。
K B Mullis
1985年穆利斯发明了高效 复制DNA片段的聚和酶链 式反应（PCR）技术，利 用该技术可从极其微量的 样品中大量生产DNA分子， 使基因工程获得了革命性 发展。
?1972年美国斯坦福大学的P. Berg研就究小组使用限制性内
切核酸酶 (restriction enzymes)EcoRI对病毒Sv40DNA 和λ 噬菌体进行酶切，然后用T4DNA连接酶将两种片段连接起来, 第一次在体外获得包括Sv40DNA和λ噬菌体的重组DNA分子。?1973年S. Cohen 将两种分别编码卡那霉素(kanamycin)和 四环素(tetracycline)得抗性基因相连接，构建出重组 DNA 分子，转化大肠杆菌，获得既抗卡那霉素又抗四环素双重抗 性特征得转化子菌落，基因工程由此诞生。1975年 建立单克隆抗体技术
1978年 大肠杆菌表达出胰岛素
1988年 PCR方法
1997年 英国克隆多利羊
1.2.3 基因工程的发展
1. 人类基因组计划
主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传 作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的 序列测定 以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科 学家参加的国际合作计划，是迄今为止在生命科学 领域最宏大的研究计划。
1995年，科学家们获得了人类第3、第16和第22号染 色体的高密度物理图。日，科学家们宣布，人类第22号染色体， 含3.34×107个碱基序列的测定已经全部完成，这是 人类完成的第一条人类自身染色体的全序列测定。
日，人类基因组工作框架图完成，标志 着功能基因组时代的到来。
1.2.4 已完成测序工作的生物
?日:以杨焕明为首的中国科学
家在Science发表了水稻全基因组框架序列 图。
?其中10000个基因的功能已确定； ?水稻的“垃圾”序列多位于基因外，人类
?基因总数：，约为人类的2倍；
的“垃圾”序列多位于基因内；
?水稻的基因平均长度为4500bp,人类基因
平均长度为72000bp,
?拟南芥约有25000个基因，80%在水稻中都
存在，二者之间有关信号传导的基因差别 最大
?2000年3月塞莱拉公司宣布完成了果蝇的基
因组测序。
?日英美等国科学家宣布绘出
拟南芥基因组的完整图谱。这是人类首次全 部破译一种植物的基因序列。
?2001年:1、2月，HGP和美国塞莱拉
（Sequencing）公司将各自测定的人类基因 组工作框架图分别发表在Nature和 Science 上， 这表明人类基因组计划（HGP）进入了 一个展新的阶段。
1.2.5 正在进行或即将完成测序工作的生物
? 美国研究人员09年11月19日宣布完成了玉米的全基因组测序 工作，玉米共有10对染色体，约3.2万个基因，23亿个碱基对 ，是目前已测序的植物中基因数量最多的品种。85%的碱基 序列是重复的。
?美国科学家《自然》杂志上公布了一只１２岁大斗拳狗的 完全基因组图谱，该图谱将有助于理解一些特定基因的演化， 并将促进对人类和犬类共患疾病的研究。?国际马类基因组序列计划（the international Horse Genome Sequencing Project）宣布，科学家们首次完成家 马（(Equus caballus)）的基因图谱草图，得到了270万个 DNA碱基对的数据。
?英国曼彻斯特大学牵头的国际科研小组破译出了曲霉菌、米曲 霉素和烟曲霉素三种霉菌的基因组序列并绘制出基因图。?普渡大学开展大豆基因组研究计划 ?非典型性的Haemophilus influenzae致中耳炎病菌株的测序工作
?家猫、马铃薯、海藻、牛基因组测序工作
?美国科学家在21日出版的《自然》杂志上公布了常见的稻 瘟病菌的基因组草图，这是科学家首次完成植物病原体的基 因测序。
?腔棘鱼是腔棘鱼科的一种大部分已灭绝的鱼。最近，由斯 坦福大学的Richard Myers博士与Benaroya研究所的Chris Amemyiya博士合作领导的研究组破解了一种“活化石”鱼 类――腔棘鱼的遗传密码。
?细菌Dehalococcoides ethenogenes 的基因组进行了测 序，这种细菌有清除地下水中由干洗和制造计算机的化学 物质所造成的污染的能力。?美国国家卫生研究院 (NIH) 的美国人类基因组研究 所 (NHGRI) ，宣布将与位于墨尔本的 Australian Genome Research Facility Ltd. (AGRF) 进行合作计 划。他们将为澳洲最有名的动物 ― 袋鼠，进行基 因测序的计划。
?中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所等6个单位 最近完成的《痢疾杆菌全基因组序列测定与分析》科 研课题，从分子水平对我国流行的痢疾病原菌优势菌 株――福氏2a痢疾杆菌301株的致病机理和耐药机制进 行了研究。取得了一系列具有原创性的科研成果。
?美国、加拿大、新西兰，以及澳大利亚在内的4个国 家为奶牛基因组的测序工作筹措了总数达5300万美元 的资金。
?科学家新近对一种昆虫病菌的基因组进行了测序， 并分析获得了这种被称为P. luminescens的细菌的全 部基因组顺序。这项研究成果发表于2003年11月号 《自然-生物技术》。该成果可能为控制害虫带来新 方法。
1992年，酵母3号染色体DNA的全部315 357个碱基序列的测定， 这是人类完成的第一条真核生物染色体DNA的全序列。1996年，科学家们完成酵母其他15条染色体的碱基序列测定。1997年，大肠杆菌基因组序列测定宣告完成。
科学家们对人类基因组的性质和作用的认识在不断地深化。
未来：健康领域、基础科学研究领域……
1.2.6 后基因组学研究(post-genomics) 是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上，进一 步研究全基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机 制为主要内容的学科。后基因组学主要利用DNA微列阵技术、蛋白质组学、酵母菌双 杂交系统以及生物信息学等技术相结合，对已知的基因组序 列进行研究。主要有转录组学研究:从mRNA水平来研究基因组的基因表达，分析基 因表达水平、数量、以及在不同组织和发育阶段表达差异。蛋白质组学研究:蛋白质组学(proteomics)是从蛋白质水平来 研究基因组的基因表达，分析基因组的蛋白质类型、数量、 空间结构变异以及相互作用的机制。在蛋白质分析中，目前 主要利用奥佛诺(O Farrel，1975)发明的据蛋白质的等电点 和分子量分析蛋白质的双向电泳技术，来分析蛋白质组 (proteomes)，
1.2.7 生物信息学研究
生物信息学(bioinformatics)是利用计算机贮存原始 资料，分析生物信息，将DNA芯片以及蛋白质双向电 泳结果转变成为可读的遗传学信息的学科。生物信息 学是将现代生物技术与计算机科学结合，收集、加工 和处理生物资料。具体来说，它是将数学、统计学、 计算机方法结合起来，用于综合、分类、分析和阐述 生物信息的科学。
1956HbsGlu-Val
1972重组质粒 第一个R酶
1996酵母基因组序列 1986位置克隆 1983HD病G定位 90 1995
1944DNA是遗传物质
1949Hbs贫血 1953双螺旋 1966遗传密码 1975DNA杂交
现代分子遗传学发展
1977DNA测序 1981转G小鼠 1985PCR 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列
1 基因工程的基本概念
1. 3 重组DNA技术与基因工程的基本用途
1. 3. 1 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 1. 3. 2 大规模生产生物活性物质 1. 3. 3 设计、构建生物的新性状甚至新物种
1. 3. 1 大规模生产生物活性物质
野生细胞 分离工程 分 离 工 程 酶 野生细胞 基因工程 蛋白质工程 途径工程 工程细胞 发酵工程 细胞工程 生物活性物质
1.特殊蛋白质的大量生产
乳汁中分泌人凝血因 子IX的转基因山羊
美国转基因猪，其体内含有人类的 基因，乳汁含有人体蛋白fatorⅧ。只需300～600只这样的母猪就能满 足全世界对这种蛋白的需求。
从猪和牛的胰脏提取，获得100g胰岛 素需800－1000kg的牛胰脏。现在用基因工程方法 在大肠杆菌中表达产生。
?人生长激素
具有物种特异性，只能用人的生长 激素来治疗侏儒症。以前从尸体脑垂体中提取， 来源非常有限，现在用基因工程方法在大肠杆菌 中表达产生。
体外培养人体细胞来生产，产量低，成 本高，现用重组大肠杆菌生产。
2.动物植物的遗传改良
不易腐烂的番茄
兔毛棉花在我国培育成功：用 兔的一种角蛋白转化棉花，棉 花纤维质量好，具有兔毛般的 光泽。
3.基因工程在动物中的应用
转基因小鼠：导入 人类基因，具有较 强的学习能力。在 迷宫实验中，转基 因鼠觅食本领比普 通鼠要高许多，同 时对迷宫中食物存 放地点记忆更清楚。
浙江理工大学教授张耀洲的“家蚕生物反应器 生产生物制品的方法”获得国家技术发明奖二 等奖 长江大学承担的湖北省重点科技发展项目－－ “鸡传染性法氏囊病基因工程疫苗开发研究”项 目历时５年攻关，研制出了我国首剂禽类传染病 基因工程疫苗。美国研究人员２３日宣布，他们通过基因植入 技术将普通实验鼠改造成了耐力大增的“马拉 松运动员”，并且这种基因工程改良过的老鼠 即使不运动、吃高脂肪食物也不会长胖。
4.人类基因治疗
日美国政府首次批准了一项基因治疗临 床研究计划：对一台患有腺苷脱氨酶（ADA）缺陷的 重度联合免疫缺陷症（SCID）4岁女童进行基因治疗 并获得成功。该患者今年已经20岁了。从而开创了 医学界的新纪元。
5.基因工程在生物医药中的研究和应用
1.新型疫苗的研制
艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。2.基因工程活性肽的生产 基因药物:淋巴因子、生长因子、 3.激素和酶干扰素、白细胞介素、粒细胞集落刺 激因子、红细胞生成素、纤溶酶原激活剂、胰 岛素、生长激素、乙肝疫苗等
4. 已上市的基因工程药物和疫苗
1995年 白细胞介素-2
1996年 α1b-干扰素，α2a-干扰素， α2b-干扰素 1997年 粒细胞集落因子，红细胞生成素 1992年 乙型肝炎疫苗
5.广州拜迪生物医药有限公司的重组人粒细胞巨噬细胞刺 激因子（GM-CSF）通过了国家药品GMP认证现场检查。6.俄罗斯医学科学院外科手术科学中心和俄罗斯科学院 分子遗传研究所成功研制出用于血管再生的独特基因工 程结构。这种基因工程结构含有血管生长基因，将其移 植到下肢严重贫血疾病患者体内，可避免患者截肢，治 愈疾病。7.注射用基因工程双功能水蛭素（RGD-Hirudin，治疗 性生物制品一类）由复旦大学分子医学教育部重点实 验室宋后燕教授领衔研究。近日，该药获国家食品药 品监督管理局批准，正式进入临床研究。
8. 北京沙东生物技术有限公司研究开发的基因工程抗肿瘤 新药重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(简称CPT) 研究获得国家科技部中小型创新基金100万元无偿资助，同 时获得国家863重大科技专项立项。9. 浙江大学科研人员利用家蚕研制成功一种基因工程药物― ―瑞福康。该药对治疗骨髓增生异常综合征、 再生障碍贫血 和骨髓衰竭，支持骨髓移植后干细胞的生长和造血功能的恢 复以 及预防白细胞减少时可能潜在的感染并发症均有效果。10. 恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗初步解决这一难题， 使肿瘤患者在肿瘤切除后的康复率得到提高。
11.复旦大学生命科学院郑兆鑫教授上周赴京领 取了猪口蹄O型疫苗的国家新药证书。这也是世 界上唯一的猪口蹄疫基因工程疫苗。12.基因工程必特霉素（曾用名生技霉素）为国 内外首创的基因工程抗生10. 恶性肿瘤广谱基因 工程纳米疫苗初步解决这一难题，使肿瘤患者在 肿瘤切除后的康复率得到提高 素，获中国专利。
13. 中国医学科学院医药生物技术研究所微生物 代谢工程室主任王以光研究员主持研究的必特霉 素及其基因工程高产菌株获我国专利。14. 上海华谊集团在世界上首次成功利用基因工 程技术，规模化生产治疗糖尿 病的多肽药物。
6. 基因工程在工业中的应用
1.《跨界融合构建基因工程菌处理石化废水的研究》课题 运用了基因工程，融合3个跨界亲株微生物，构建出了特 殊菌株。该菌株兼具了各种传统菌种的高降解性、高适应 性和高絮凝性等特点。经过合作各方历经4年的努力，该 项目逐步建立了基因表达、营养条件、工艺操作三项优化 调控技术，对二甲苯、苯甲酸、邻苯二甲酸、4－羧基苯 甲醛和对苯二甲酸5种有机污染物的降解率分别高达86％、 94％、99％、97％和94％，总有机碳去除率达到94％；处 理出水的Cu、Mn、Zn、Se浓度低于国家允许的排放浓度； 所检测的生物毒性明显降低。
7. 基因工程在农业及食品中的应用
美国科学家据此提高马铃薯淀粉含量达20%-40%，最 高达40%-60%。目前改良作物产品质量的基因及应用 主要有：控制果实成熟的基因；谷物种子贮藏蛋白 基因；控制脂肪合成基因；提高作物产量基因等。世界上有43种农作物品种得到改良，如水稻、番茄、 马铃薯、瓜类、烟草等等。利用基因工程技术将一些微生物、动物或植物的基因植 入另一种微生物、动物或植物中，接受的一方面由此获 得了一种它所不能自然拥有的品质。它可分为：植物性 转基因食品、动物性转基因食品和基因工程菌。
我国在抗逆基因的分离、克隆和转化等方面的研究有新 进展，已克隆了耐盐碱相关基因，通过遗传转化已获得 了耐2%NaCL的烟草；耐1％Na-CL的苜蓿和耐0.8%NaCL的 草莓。
抗病基因工程育种主要是将病毒外壳蛋白基因移植到 农作物中，使农作物能抵抗病毒感染，培育出抗病毒 番茄、抗病毒烟草、抗病毒黄瓜等作物新品种。中国 农业科学院生物技术研究中心与作物所合作，将几丁 质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦，育成双价抗病转 基因小麦，抗赤霉病、纹枯病和根腐病等真菌性病害。
日前经常使用的主要有三种：一是从微生物苏云金杆菌分离出 的苏云杆菌杀虫结晶蛋白基因，简称Bt基因；二是从植物中分 离出的昆虫的蛋白酶抑制剂，其中应用最广泛的是豇豆胰蛋白 酶抑制剂基因(CpTI)；三是植物凝集素基因(lectin gene)。
巴基斯坦的分子生物学研究中心运用转基因的方法 开发出了一种“印度香米”的新品种。
自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短 短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十 分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种 以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、 大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、 黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生 菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草； 苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮 牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以霸占杨 树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令 人鼓舞的突破性进展。
基因工程技术的应用为农业微生物遗传改良与各类微生物杀虫 剂的开发开辟了新的途径，目前的研究已经显示了这项技术发 展的巨大潜力。应用基因工程技术生产和修饰改造这些生物杀 虫剂，对微生物制剂用于虫害治理开创了新局面。
植物抗病基因工程指的是用基因工程(遗传转化)的手段提高植 物的抗病能力，获得转基因植物的方法。培育出新抗病品种， 大幅度地提高粮食产量。
1 基因工程的基本概念
1.4 基因工程实验方法及步骤:
1. 目的基因PCR扩增及纯化（酶切）; 2. 连接到相应的载体（PGEM-T） ； 3. 转化到感受态大肠杆菌并表达 （1）大肠杆菌培养。（2）感受态大肠杆菌的制做。（3）做LB平板培养基。（4）转化连接目的基因的载体。（5）将转化后的感受态大肠杆菌涂布于平板， 37℃培养20-22小时，挑白斑。（6）制做液体LB培养基培养白斑，摇床上摇1012小时。（7）提取质粒，双酶切，电泳及测序。4. 蛋白质纯化及功能分析
1 基因工程的基本概念
1. 5 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程
第四代基因工程 基因组或染色体的转移
基因组工程
第一篇:基因工程的概念DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具
1、原理：基因重组 原理2、操作水平：DNA分子水平 操作水平：DNA分子水平 又称3、又称重组技术或基因拼接技术 DNA重组技术或基因拼接技术 DNA 4、优点优点⑴ 定向改造生物性状 ⑵ 克服远缘杂交不亲和的障碍 ⑶ 育种周期短
一、基因工程的概念
基因拼接技术或DNA DNA重组技术 基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 实质 结果 生物体外 基因 DNA分子水平 DNA分子水平 剪切 → 拼接 → 导入 → 表达 基因重组 人类需要的基因产物
二、基因工程的基本工具 看书，思考以下问题看书，思考以下问题：
1、基因工程中三种基本工具的作用分 别是什么？ 别是什么？ 工具酶的作用部位分别在哪？ 2、工具酶的作用部位分别在哪？ 具备什么条件才能充当“ 3、具备什么条件才能充当“分子运输 车”？
? 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 关键步骤一的工具：基因的剪刀 关键步骤一的工具：基因的剪刀 剪刀――限制酶 限制酶 关键步骤二的工具：基因的针线 关键步骤二的工具：基因的针线 针线――DNA连接酶 DNA连接酶 DNA 关键步骤三的工具：基因的运载工具 关键步骤三的工具：基因的运载工具 运载工具――运载体 运载体
（一）“分子手术刀”――限制性核酸内切 分子手术刀” 限制性核酸内切 酶 1、来源主要来自原核生物 来源：
2、特点具有专一性（特异性） 特点具有专一性（特异性）
表现在两方面表现在两方面(1)识别双链DNA中特定核苷酸序列 识别双链DNA (1)识别双链DNA中特定核苷酸序列 (2)从特定部位的两个核苷酸之间切开 (2)从特定部位的两个核苷酸之间切开
3、作用特定部位的两个核苷酸之间的 作用：
磷酸二酯键断开 结果4、结果产生黏性末端或平末端
SmaⅠ SmaⅠ
EcoRⅠ EcoRⅠ
黏性末端和平末端
限制酶所识别的序列有什么特点
? 限制酶所识别的序列，无论是6个碱 限制酶所识别的序列，无论是 个碱 基还是4个碱基 个碱基， 基还是 个碱基，都可以找到一条中 心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的 心轴线，中轴线两侧的双链 上的 碱基是反向对称重复排列的。
DNA连接酶 （二）“分子缝合针”――DNA连接酶 分子缝合针” DNA 1、种类种类⑴ E?coli DNA连接酶 coli DNA连接酶 ⑵ T4 DNA连接酶 DNA连接酶
2、作用作用：
E?coli DNA连接酶 DNA连接酶
或T4DNA连接酶 DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 缝隙 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键
DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 连接酶还可把平末端之间的缝隙 T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来， 起来，但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ 连接酶与DNA聚合酶是一回事吗
DNA连接酶 DNA连接酶 连接DNA链 连接DNA链 双链 DNA 在两DNA DNA片段之 在两DNA片段之 间形成磷酸二 间形成磷酸二 连接部位 酯键
DNA聚合酶 DNA聚合酶 单链 将单个核苷 酸加到已存 在的核酸片 段上， 段上，形成 磷酸二酯键
（三）“分子运输车”――运载体 分子运输车” 运载体
常用的运载体常用的运载体：
质粒、 质粒、 噬菌体和动、 噬菌体和动、 植物病毒等
载体必须具备的条件
如果载体对受体细胞有害将怎样？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞， 目的基因是否进入受体细胞，没有 标记基因我们能否鉴定？ 标记基因我们能否鉴定？ 假如目的基因导入受体细胞后不能 复制将怎样？ 复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？
作为载体的必要条件 1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保 存； 具有多个限制酶切点， 2、具有多个限制酶切点，以便与外源 基因连接； 基因连接； 具有某些标记基因，便于进行筛选。3、具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、 （如抗菌素的抗性基因、产物具有 颜色反应的基因等 ） 4、对受体细胞无害
（三）“分子运输车”――运载体 分子运输车” 运载体 需要具备的条件1、需要具备的条件：
（1）在受体细胞中稳定存在，能自我复制 ）在受体细胞中稳定存在， （2）有一个或多个切割位点 ） （3）有标记基因 ） （4）对受体细胞无害 ）
2、种类种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等 质粒、噬菌体、
反馈练习反馈练习：
以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析片段，试分析以下是两种限制酶切割后形成的 片段 ①GC… ②AATTC… ③ …GC ④ …CTTAA CG… G… …CG …G (1)其中①和 其中① 其中 末端， 末端， （2） ） 和 末端， 末端， 是由一种限制酶切割形成的 是由另一种限制酶切割形成的
在基因工程中， 在基因工程中，切割运载体和含有目的基因 DNA片段 需使用（ 片段， 的DNA片段，需使用（ ） A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
? 基因工程常用的受体细胞有（ 基因工程常用的受体细胞有（ ） (1)大肠杆菌 (1)大肠杆菌 （2）枯草杆菌 （3）支原体 （4）动植物细胞 ）（4 ）（2）（4 A. （3）（4） B. （1）（2）（4） ）（3）（4 ）（2）（3 C. （2）（3）（4） D. （1）（2）（3）
不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA 它是环状DNA ( D）
1、下列不适合用于基因工程的运载体 是（ C ） A、质粒 B、噬菌体 选 审题 我 C、细菌 D、病毒 2、下列说法正确的是：（ D ） 、下列说法正确的是：（ A、限制酶的切口一定是 、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 、 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、 、重组技术所用的工具酶是限制酶、 连接酶、 连接酶、运载体 选 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 、 我 进行大量复制的过程可称为“克隆” 进行大量复制的过程可称为“克隆”
3、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的 、 是（ A ） ① T C G ② A A T T C
A G C T T A A A G G T T C C A G
A G C T T C A G
A、①② B、①③ C、①④ D、②③ 、 、 、 、 4、下列哪一种酶是基因工程的工具酶（ A 下列哪一种酶是基因工程的工具酶（
A、DNA连接酶 DNA连接酶 C、RNA酶 RNA酶
B、DNA酶 DNA酶 D、运载体 记住了
基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工 在基因操作的基本步骤中， 的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基 互补配对的步骤是 （ C ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达
第一篇:基因工程的概念转录本是由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的 mRNA。一条
基因通过内含子的不同剪接可构成不同的转录本。(不含内含子的 MRNA）
假基因指基因组中与正常基因相似，但缺乏功能的 DNA 序列。原先可能是正常功能基
因，由于碱基缺失等变为无功能的假基因。一般不参与蛋白质编码。
单核苷酸多态性(SNP)
是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺
cDNA 文库指以 mRNA 为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成 cDNA，与适当
的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段 cDNA，并能繁 殖扩增， 这样包含着细胞全部 mRNA 信息的 cDNA 克隆集合称为该组织细胞的 cDNA 文库。
多克隆位点（MCS)
DNA 载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源 DNA 提 供多种可插入的位置或插入方案。GC 碱基含量越高的片段越难通过 PCR 的手段获得 DNA 聚合酶往往很难通过这高 GC 区
?通过 PCR 突变成 xba I 的 DNA 片段
单酶切就是只用一个限制性内切酶去切你的质粒，环状的质粒就成为线状的了，但质粒
的大小不变
双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成
两段线状 DNA 了。回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末 端（当然目的基因也要用这两种酶切才行） ，在 T4DNA 连接酶在作用下，它们就连到一起 了。
bp=1 碱基对
质粒的拷贝数
质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的数量。
为了保证酶不失活，缓冲液一定比酶早加。同样的，为了防止引物降解，需要先加 dNTP。
至于 PCR 缓冲液和 dNTP，还有引物和模板的加入顺序，我没发现对 PCR 产生明显的影响。牛血清蛋白（BSA）中的 BSA 就是“牛血清蛋白”的英文缩写简称。
Taq 类 DNA 聚合酶扩增的 PCR 产物或者平端“加 A”后的产物用 T 载体，而用 Probest 等 有校正活性的 DNA 酶扩增的 PCR 产物则应该用 pEasy-Blunt 载体。载体和插入片段的摩尔比应该在 1：3 以上
若转化高浓度的小提质粒，即所谓的“阳转”，往往0.1μ L的DNA溶液就够了，如果转化连 接产物，则应该尽量提高连接产物的量，但最好不要超过感受态细菌菌液体积的5%）
EB（Ethidium bromide，溴化乙锭）
溴化乙锭是一种高度灵
敏的荧光染色剂， 用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的 DNA。溴化乙锭用标准 302nm 紫 外光透射仪激发并放射出橙红色信号， 可用 Polaroid 底片或带 CCD 成像头的凝胶成像处理 系统拍摄。
反义 RNA 是指与靶 RNA 具有互补序列均调节 RNA,它通过与靶 RNA 的碱基配对而起负调 控作用,转录产生反义 RNA 的基因称为反义基因
PCD 是牙齿胚胎发育过程中上皮－间充质相互作用所发生的一系列细胞反应中的重要调
控机制。首先当上皮信号分子一出现，上皮细胞增殖、内陷形成蕾状上皮性突起，这时 PCD 活跃在上皮性生长中心蕾状突起的头部，说明 PCD 调控着细胞增殖，控制着上皮性成釉器 的雏形。当信号向间充质传导，诱导间充质细胞增殖，形成间充质细胞凝集区，牙乳头、牙 囊开始形成，此时，PCD 又出现在帽状成釉器中以内釉上皮凹面中心为主的生长中心（原 发性釉结节）及颈环处，提示 PCD 在调控着细胞的增殖和分化，调控着牙尖、牙颈、牙根 部的形成，使牙胚不断发育扩大的同时得以塑形。随着上皮－间充质相互诱导，成釉细胞、 成牙本质细胞的分化成熟，牙本质、牙釉质基质的分泌形成，钟状期及牙体组织形成期， PCD 主要清除已经结束生命周期的衰老的多余的上皮及间充质细胞，控制着细胞数量，消 除釉结节及星网层等暂时性结构。可见，在牙齿发育过程中，PCD 参与上皮－间充质相互 作用，及时调控着细胞的增殖数量，及时清除异常、衰老的细胞及暂时性结构。在牙齿形态 形成过程中，发挥重要的塑形作用
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