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转染资料整理终结版
转染转染――让克隆的核酸进入真核细胞中， 已经成为研究和控制真核细胞基因表达 的重要手段。 比如表达纯化特定的蛋白； 鉴定一个基因的生物学特性； 突变分析； 研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。如今广 义的转染不单包括了 DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。生物通在前面已 经为大家集中介绍了 8 个不
同的品牌的转染试剂――不是选美， 没有包医百病的 万灵丹，只是希望有助于你了解每种产品的特性。这里我们最后“唐僧”一下，转 染中一些值得注意的事项。 很多因素会影响转染效率， 细胞株本身啦， 细胞培养环境啦， 转染的 DNA、 RNA 或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。每个转染高手也必然有自己的独 门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来 仔细总结经验汇集成文字――那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经 验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到 模糊。即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。试剂盒的盛行， 让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起 Protocol 123 地往 下做，直到碰壁再苦思原因。其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑， 只要事前注意了就不会陷进去的。幸好还有一些资料可寻，生物通姑且在这里抛 砖引玉，罗列一些吧。这一 part 很闷的。 DNA 转染后，转入基因的表达可以在 1－4 天内检测到――仅有一部分转入 细胞的 DNA 被转运到细胞核内进行转录并最终输出 mRNA 到细胞质进行蛋白合 成。几天内，大部分外源 DNA 会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就 检测不到其存在了。因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染 （transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高 水平表达，可在 24―96 小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到 周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为 DNA 摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。超螺旋质粒 转染更倾向于瞬时表达。瞬时表达适合研究启动子等调控元件――不过，诱导型 的启动子除外。稳定转染，就是转染的质粒 DNA 整合到染色体上，或者相当于 附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。外源基因整合的 几率很小，要获得稳定转染的细胞株，通常需要有筛选标记（比如抗性基因）共同转染，通过选择压力维持表达的稳定――不行的统统枪毙了。质粒整合到染色 体上本来就是件稀罕事儿，平均万分之一的几率，如果是线性化 DNA 转染，那 整合的几率就高多了。不过怎么整合也就是一个或者有限的几个拷贝，所以表达 量往往比较不高的。但是，“压倒一切的是'稳定'”，很多时候，转染后往往要进 行稳定表达的筛选。 成功转染第一步： 成功转染第一步：细胞培养注意事项 细胞系的选择通常不是我们说了算的。有时是实验的需要，有时是实验室条 件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原 代细胞，通常越是难于伺候。反之亦然。此外细胞本身的特性也是需要考虑的因 素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法；而有时一些启动子在不同的细 胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素，姑且不论。不 过因为受限于特定的细胞，如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的 细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法，照 做可也。如果是个新来的细胞株，最好查查资料看哪些成功转染案例。每种转染 试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献， 看看其中是否有你的新对 手――这个 FuGENE 6 比较有优势，已有 750 多种细胞系成功转染的资料可供 参考。 生物通的聚焦转染专辑里面也一一列出查阅各主流转染试剂相关数据的网 址。当然这只是参考而已，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变， 总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变 化。 当实验进行到转染这一步时需要注意的因素有哪些呢？ 一、健康而茁壮成长的细胞 转染前细胞最好经过 1―2 次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。注意， 贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代， 千万不要使细胞保持融合 超过 24 小时，因为一旦长满了，细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的 年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物嘛。大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年 后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的 细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原 先的转染活性。比如，新鲜融化的 NIH 3T3 细胞比传代 8 次的细胞表现出更高 的转染效率（融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率）。因此，如果观察 到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。 二、恰到好处的铺板密度 转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时 的最适细胞密度各不相同， 即使同一种试剂， 也会因不同的细胞类型或应用而异。 转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此 如果选用新的细胞系或者新的转染试剂， 最好能够进行优化实验并为以后的实验 建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密 度为 40%-80%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书――阳离子脂质体具有微 量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数， 有的要求细胞 90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在 40%―80%之间，总之是尽量 在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。 不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度， 比如研究细胞周期相关基因等 表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度 下进行转染的试剂。需要特别注意。 三、温暖舒适的培养基 健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性，需 要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。如果是培养新手，可留意随后的生物 通细胞培养专辑，我们就不罗嗦了。还是专心介绍几种添加剂在转染过程中“影 响因子”吧。 血清 血清一度曾被认为会降低转染效率， 老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染， 对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个 难题。不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的 存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，比如 FuGENE6、 Effectene 和 GeneJuice 等。 对于多数可以在有血清条件下工作的转染试剂来说， 血清的存在会影响 DNA―转染复合物的形成， 但只要在 DNA-转染复合物形成时用 无血清培养基来稀释 DNA 和转染试剂就可以了，在转染过程中是可以使用血清 的。这些方便好用、可在有血清条件下转染的试剂包括前面介绍的 Lipofectamine2000，FuGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect 等等（看看 生物通前面的介绍吧） 最厉害的是 Qiagen 的 2 个产品， 。 Polyfect 和 Effectene， 全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，包括稀释步骤，不 用担心培养基的变化对细胞生长有什么不良影响了。这样，就不再需要在转染前 多次洗细胞，也就减少操作的复杂程度，更重要的是不必再让细胞处于无血清的 “悲惨环境”中转染，不必担心对血清缺乏很敏感的细胞受到不必要的麻烦了。 娇贵的细胞们，你们有福了。不过要特别注意：对于 RNA 转染，如何消除血清 中潜在的 RNase 污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培 养基的预热对细胞转染很有帮助。 抗生素 支原体、 细菌、 真菌污染， 无论对于细胞培养或者转染都是“不堪回首的痛”， 可能会严重影响转染结果，细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。但是 这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基 添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的 通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。 所以，对于选择 Lipofectamine2000 系列转染试剂的实验，要特别注意在转染培 养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生 素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使 用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是 GENETICIN 选择性抗生素的竞争性抑制 剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少 的抗生素量。这里又要表扬 Qiagen 的 2 个产品，Polyfect 和 Effectene，因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，很方便的。对于筛 选稳定表达株，要预留足够的时间让抗性基因表达后再添加筛选压力。 其他添加物如抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸， 硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖这些物质的存在可能会干扰 DNA 和转染试剂形 成复合物的过程，要尽量避免。 一、质粒的构建：启动子的选择 质粒的构建：启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。 对于转染过程本身虽 然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。启动子可分为 2 大类：诱导型 启动子是比较精明的，平时歇着，一旦接到诱导信号指示就马上开工干活儿。而 组成型启动子比较老实的， 就是从头到尾不停干活从不闲着的那种――比如我们 很熟悉的 CMV 启动子啊，SV40 啊，pMC1 啊，PGK 启动子啊等等。 获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。 CMV 启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。在 BHK-21 中，CMV 启动子 活性比其他启动子如 SV40 和 RSV 都要高。但这三种病毒启动子在 T 细胞来源的 细胞系，如 Jurkat 中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入 PHA-L 和 PMA 可以激活 Jurkat 细胞中 CMV 启动子，而单 PMA 就足以激活 KG1 和 K562（人骨髓 瘤白细胞）中的 CMV 启动子。SV40 启动子的表达在含有大 T 抗原（存在于 COS-1 和 COS-7）时会提高，因为大 T 抗原可以刺激染色体外的合成。 一个强悍的高表达组成型启动子是我们做表达所求之不得的， 但是对于转染 本身来说却不一定好――因为任何持续过高表达外源基因都可能带来某种程度 的细胞毒性， 影响细胞生长――如果外源基因本身对细胞生长有毒， 那更完蛋了， 你很可能筛不到转染成功的细胞株， 更别提稳定转染了――因为过量表达本身可 能已经害死了那个转染了的细胞，没转染的细胞又死于筛选压力。这种时候一个 不那么“能干”的启动子可能更适合一些。 如果你曾经遇到原因不明的转染失败 案例，会不会是这个原因呢？过犹不及就是这个道理咯。诱导型启动子对于转染来说，特别是稳定转染，可能是更好的选择。它使得 目的基因的表达可以受到我们的调控――转染的时候不表达， 筛选稳定表达株后 再诱导表达， 使得表达有毒性的基因或者精确分析表达产物的生物学效应成为可 能。多数诱导型启动子在接受某种信号后“打开开关”开始工作，也有的相反， 在缺失某种信号后打开开关。Clontech 还有个诱导系统是“剂量依赖的”，就 是说不单表达开关可控，表达量多少也可以通过诱导剂的量来调控。还有一种特 殊的启动子很好玩――具有时序性或者组织特异性（空间特异性），会受到特定 的元件调控，在一定的时间或者特定组织细胞中表达的，比如那个转基因山羊奶 里用的只在泌乳期的乳腺细胞中表达的启动子――有人说这是组成型的， 我觉得 应该是诱导型的，只不过诱导的因素我们不知道罢了，这类启动子在不同的细胞 中会有不同的表现，需要注意。诱导系统的问题主要是本底表达，表达量有限， 以及诱导剂本身对细胞的影响和如何清除，不过这些都不关转染的事，我们等生 物通的表达专辑时再慢慢说吧。 转染 DNA 的启动子-增强子如果不被宿主细胞识别也会产生无法表达的“悲 剧”，这是实验设计时需要注意的问题。不过现在利用现成试剂盒或者模拟国外 已经成功的实验的居多，独立构建表达系统的极少，因而这种问题遇到的几率也 几乎可以忽略不计。目的基因：这个对于研究人员来说是目的，因而没有选择的余地。如果你的目的 目的基因 基因正好会影响选定细胞株的生长， 甚至有毒， 那最好选择一个诱导型的启动子， 不然你可能总是转染不了。 但是通常在实验之前我们不清楚我们研究的基因产物 是否对选定的细胞有毒， 所以正负对照很重要。 当排除其他原因后转染总是失败， 应当从根本上考虑原因。 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果： 超螺旋质粒的转染 二、 效率比线性 DNA 高得多，特别是瞬时转染。而线性化 DNA 转染的整合几率高。质 粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率 要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进 DNA 凝聚的成 分，使得 DNA 形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。 纯化质粒的质量无疑会影响转染效率。 哺乳动物细胞总归是比大肠杆菌娇气， 转 纯化质粒的质量 染难度高些，因而要求的 DNA 纯度要更高些。早年要做转染真是大阵仗啊，光是 提质粒做超离就令人皱眉。最令人头疼的是内毒素了。内毒素是革兰氏阴性菌细 胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的类脂 A（lipopolysaccharides），在细 菌被裂解时被释放出来，由于其化学结构和特性，在质粒提取的过程中内毒素很 容易混入质粒 DNA 中共同纯化出来。内毒素的存在会严重地影响转染效率，此外 内毒素可能会激活造血细胞（例如 B 细胞、巨嗜细胞等）的非特异免疫反应，造 成实验中的假阳性。所以质粒 DNA 转染时应尽量采用无内毒素污染的超纯质粒。 幸好技术的进步令复杂的操作成为过去， 多数实验室会选择使用转染级别的质粒 纯化试剂盒纯化的质粒来转染。对于一些“耐受性高、容易操作的”细胞株，普 通的 Kit 已经够了。对于一些对内毒素特别敏感的细胞，就要用“去内毒素”的 质粒纯化 Kit 了。Qiagen 的 Endofree 系列可以得到相当于 2 次 CsCl 超速离心 纯度的质粒，同时特别设计去除内毒素，专为最娇气的细胞系转染和体内 DNA 疫苗而设计。 此外现在 Invitrogen 和 Stratagene 都有一些快速纯化质粒同时也 去内毒素的 Kit，使得去除质粒中的内毒素更为简便（参考生物通质粒纯化专 辑）。 的浓度和量： 初学者通常都不会在乎甚至 质粒 DNA 的浓度和量 既然质粒纯化已经不成问题， 愿意多加点 DNA，但是要注意的是，DNA 量过少固然转染效率不高，DNA 量过多 同样会降低转染效率。有的初学者习惯按照说明书 123 地去操作而不求甚解，你 “知其然”是否还“知其所以然”呢？DNA:转染试剂的比例的优化是非常重要 的，特别是对于阳离子脂质体、多胺等带电荷的转染试剂来说，DNA-转染复合物 所带的净电荷是由转染试剂和 DNA 的比例决定的， 而转染复合物是否能更好地结 合到带负电的细胞膜上，很大程度取决于这个净电荷。所以预实验需要按照说明 书的要求，按一定比例混合适量的质粒 DNA 和转染试剂。有的转染试剂要求 DNA 的量多些，有的转染试剂效率高只要很少 DNA，比如 Effectene 只需要常规五分 之一的 DNA。所以转染前最好能精确定量质粒。另外由于质粒本身的因素（比如目的基因产物是否有毒、启动子强弱等因素），单独 DNA 也会对细胞生长有一个 基础的影响，所以同时做几组不同量的对照实验进行优化是很有帮助的。另外值 得注意的是，当细胞铺板密度较高时，需要的质粒 DNA 和转染试剂的量也会略微 提高。 不同的实验技术都是为了满足不同的实验需要，RNA 转染提供了另一种有别于 DNA 转染的研究探索手段――直接将体外翻译的 RNA、或者病毒 RNA、或 RNA oligos，或 siRNA、甚至核糖体利用转染技术带入细胞中。由于不需要经过转录 即可直接翻译，RNA 转染得到的结果比 DNA 转染更快更直接，当然仅限于瞬时表 达。RNA 转染的这些特性很适合某些研究：比如处于非分裂期的细胞转染或者很 难用质粒转染的细胞，RNA 病毒的研究，反义 RNA 的转染，siRNA 转染（RNA 干 扰）等等。哪些因素影响 RNA 转染的效率？ 既然都是核酸，传统的 DNA 转染方法都可以用来转染 RNA，不过最头疼的就 是 RNA 容易降解和防止 RNAse 污染。 RNA 操作要注意的事项我们就不用罗嗦了，转染中要额外注意的就是转染试剂应 该是确认无 RNase 污染的， 而且也尽量避免和质粒 DNA 转染混用――即使试剂本 身兼容 DNA 和 RNA 转染，你也要想到人家做质粒 DNA 转染时往往不会这么小心， 难免将污染混入，那你岂不是很冤？多数情况下转染试剂都不建议自己分装，因 为不同的管材可能会影响转染试剂的稳定性，那就更得不偿失了。所以 RNA 专用 的转染试剂会更好一些。还有重要的一点就是要采用优质无 RNAse 污染的血清。转染时的细胞汇合度常常会比 DNA 转染高一点， 也许是因为 RNA 转染表达比 DNA 快？RNA 转染的用量必须参考转染试剂说明，因为 RNA 和转染试剂的比例决 定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞。RNA 少了 固然表达不好， 太多也会有毒性的问题。 有的品牌转染试剂有促核酸凝聚的试剂， 帮助核酸折叠为较为致密的结构。如果转染试剂对细胞没有太大影响，转染复合 物和细胞共同孵育的时间越长当然越好。 不过， 如果 RNA 本身带有荧光标记的化， 检测前通常要洗掉多余的 RNA 以免干扰结果。除了操作，RNA 本身的结构也对转染有一定的影响。哺乳动物的 mRNA 分子 带有 5'端帽子结构和 3'端 PolyA 尾巴， 此外还有成为 IRES internal ribosomal （ entry site）的核糖体结合区，这些结构或者有助于提高 mRNA 的稳定性，或者 有助于核糖体结合到 mRNA 上进行翻译。对于体外转录得到 RNA 可以通过实验加 入模拟 RNA5'端帽子结构类似物而获得这个保护性的“帽子” （Ambion 公司有提 供的），3'端 PolyA 尾巴也可以通过实验添加。多数情况下添加这些元件有助于 提高 RNA 进入细胞后的稳定性。但是有时候 IRES 元件促进翻译的进行，而到有 的细胞株中，由于缺乏相应的结合蛋白，IRES 反而影响转录。这个在 RNA 转染 实验设计中是要格外注意的。RNA 干扰实验中的 siRNA 结构对基因沉默效果也有 影响，比如推荐添加的 AA(N19)TT 结构（AA(N21)或者 CA(N21)也是可以的）。 这就不在转染的讨论范围内了。 Oligo 转染 反义寡核苷酸一度曾经是制药领域的希望之光。Oligo 的转染还是属于 DNA 转染，由于分子小，转染的主要问题是转染后的稳定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides 比一般的 Oligo 稳定，硫代 S-Oligo 可以抗拒核酸酶的 降解但不可以磷酸化，如何选择就要根据实验目的而定了。我们终于结束了转染这一部分。希望对你有所帮助。最后我们再顺带介绍通 常在转染时遇到问题该如何面对――毕竟不同的细胞和不同的实验目的， 遇到困 难往往是难于预料的，所以无论前人是否已经为你提供了现成的方法，如果是除 初次尝试某种试剂或者某种细胞系，这几个对照是一定要做的：空白对照，只加 一定量核酸的对照，只加一定量转染试剂的对照，2 个以上不同的量比实验，对 于检查问题是非常有用的。转染效率低：可能的原因：?转染试剂不适合（比如空白对照的细胞存活率就低等等）?转染试剂和核酸或者蛋白的量不够，或者比例不对（自行调整咯，别告诉 我你不会）?基因表达时间（检测时间）有问题（孵育更长时间吧，如果没有毒性问题 的化，如果毒性也随转染效率提高，那就要缩小孵育时间拉）? ? ?副作用（比如目的基因的毒性）（换诱导型启动子吧） 核酸或者蛋白质量问题（重做纯化实验） 报告基因或者检测系统的问题细胞死亡率高：?过量的转染试剂或者转染复合物（减少用量或者减少孵育时间，转染后洗 细胞）? ?细胞问题（重新复苏活化一个细胞株，或者重新传代） 目的基因毒性（减少用量）转染效率重复性差：? ? ? ?细胞汇合度不同（保证同样的接种量同样的时间） 支原体污染（杀了它吧，重新复苏一管新的） 细胞传代次数太高了（重新复苏一管新的细胞） 血清质量不稳定（一次囤积同一批号的血清吧）转染方法原理应用特点 不适用于原代细胞稳定转染、瞬时性 磷酸钙法 磷酸钙 DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞 转染 有些细胞不适用 相对简便、结果可重复 DEAE-右旋糖 带正电的 DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架 瞬时性转染 苷法 相互作用形成的复合物被细胞内吞 转染时需除血清 适用性广但细胞致死率高，DNA 和细胞用量 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的 稳定转染、瞬时性 电穿孔法 小孔导入 转染、所有细胞 件 大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条 但对细胞有一定的毒副作用 操作简便但重复性差可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞 病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 等 但携带基因不能太大细胞需处分裂期 逆转录病毒 特定宿主细胞 需考虑安全因素 特定宿主细胞 腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染 可用于难转染的细胞 需考虑安全因素 适用性广，转染效率高，重复性好，但转染 阳离子脂质体 法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合 物被细胞内吞 稳定转染、瞬时性 转染、所有细胞 时需除血清。 因为阳离子脂质体试剂的高细胞毒性，转染 效果随细胞类型变化大 带正电的脂类试剂与核酸带负电的磷酸基团形成复 脂类试剂 合物被细胞内吞 将 DNA 用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒 Biolistic 颗粒 用弹道装置投射入细胞，DNA 在胞内逐步释放，表 传递法 达 转染细胞数有限 显微注射法 用显微操作将 DNA 直接注入靶细胞核 稳定转染 瞬时性转染 多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 瞬时性转染 细胞系以及原代细胞 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴 转染、所有细胞 时无需除血清。 稳定转染、瞬时性 适用性广，转染效率高，重复性好，但转染1.纯化 siRNA在转染前要确认 siRNA 的大小和纯度。为得到高纯度的 siRNA，推荐用玻璃纤维（Roche 的核酸纯化产品采用的都是玻璃纤维， 而其他公司大都采用硅胶膜）结合，洗脱或通过 15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化 学合成的 RNA 通常需要跑胶电泳纯化（即 PAGE 胶纯化）。2.避免 RNA 酶污染微量的 RNA 酶将导致 siRNA 实验失败。由于实验环境中 RNA 酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中 的物品等，此保证实验每个步骤不受 RNA 酶污染非常重要。3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用 50 代以下的 转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。4.避免使用抗生素Roche 公司推荐从细胞种植到转染后 72 小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在 siRNA 转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。5.选择合适的转染试剂针对 siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对 siRNA 实验的成功至关重要。6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的 siRNA 转入靶细胞（同样适合实验靶 siRNA），转染 48 小 时后统计对照蛋白或 mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。过多的 siRNA 将导致细胞毒性以至死亡。7.通过标记 siRNA 来优化实验荧光标记的 siRNA 能用来分析 siRNA 稳定性和转染效率。标记的 siRNA 还可用作 siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追 踪转染过程中导入了 siRNA 的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。 常见问题及解答： Q1: 转染效率低A1::1)没有使用优化的阳离子脂质体试剂。解决建议:选择针对您的细胞类型转染效率可能最高的阳离子脂质体试剂。参见附录 A 或网站 （）上“Transfection Collection”中的参考文献列表。2)没有使用优化条件。 解决建议: 优化阳离子脂质体试剂和 DNA 的量。 参见第 7 章优化步骤。 参见网站 （ 在 Tech-online 分子生物学部分）上的细胞特异性的转染步骤。3)DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。解决建议: 在复合体形成时不要使用血清。OPTI-MEM I 培养基和 DMEM 是用 于复合体形成的较好的培养基。如果使用含有血清的培养基进行转染，保证在无血清条件形成复合物。注意：不要将 OPTI-MEM I 培养 基用于 LIPOFECTAMINE PLUS 试剂或昆虫细胞。对于 Sf9 和 Sf21 细胞，Sf-900Ⅱ SFM 会得到最佳结果。4)存在抑制剂。解决建议: 不要在用于制备 DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸 软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。5)不恰当的细胞密度。解决建议: 细胞密度应该在转染时融合度为 70%-90%。6)转染 DNA 的启动子-增强子没有被宿主细胞识别。解决建议: 确保转染 DNA 的启动子-增强子同目的细胞类型兼容。7)阳离子脂质体试剂冻结。 解决建议:不要使用冻结的或储存温度低于 4℃的阳离子脂质体试剂。8)转染分析的问题。解决建议: 转染分析中加入阳性对照。9)质粒纯化的问题。解决建议: 请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用 DEAE 树脂而非硅树脂，并 且最好是用重力流动（过滤）的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法（可用于任何级别的纯化 试剂盒） ，是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于 55℃的水浴上保温 5 分钟。最后小心地从上至下吸取 2/3 的溶液（不要碰到 底部）使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。Q2:细胞死亡率高。A2:1)DNA 量太高。 解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定最佳的 DNA 量。在剂量-反应转染中加入阳离子脂质体试剂，因为单独 DNA 也会对细胞生长有一个基础的影响。参见第 7 章微调／优化方法。2)阳离子脂质体试剂量太高。解决建议: 作一个剂量-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。在剂量-反应转染中加入 DNA，因为 单独阳离子脂质体试剂也只对细胞生长有一个基础的影响。参见第 7 章微调／优化方法。3)在转染过程中使用抗菌素。 解决建议:在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。4)细胞太少。 解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定每个转染过程中最佳的细胞数量。根据您的应用所要求的效率调整细胞数量。5)在无血清条件下细胞活性降低。 解决建议:使用 OPTI-MEMⅠ培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。在转染培养基中使用 5%到 10%的血清。确保在不存在血清的条件下形成复合物。6)阳离子脂质体试剂氧化了。 解决建议:不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。7)对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。解决建议: 在加入筛选性抗生素前至少预留 48 小时使细胞表达抗性基因。Q3:阳离子脂质体试剂-DNA 复合物沉淀。注意：在显微静下可以在细胞上观察到小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此沉淀是否存在并 不表明转染效率的高低。A3:1)存在过剩的 EDTA。 解决建议:使用 DNA 水溶液，如果是在 TE 中，使用浓度&0.3mM 的 EDTA 溶液稀释 DNA。2)DNA 或阳离子脂 质体试剂浓度过高。解决建议: 确保阳离子脂质体试剂和 DNA 的浓度不要超过复合物形成的建议量（参见表 5） 。Q4: 转染重复性不好。A4:1) 转染时的融合度波动。 解决建议:在不同的转染时报持所有的转染参数恒定，如融合度，传代次数和生长时相等。 2)在培养中细胞发生变化。解决建议: 如果可能，使用来源于经选择转染效率较高亚系的细胞。如果可能，融化新鲜细胞。针对不同阳离子脂质体的疑难解答 CELLFECTIN 试剂或 DMRIE-C 试剂 Q:试剂溶液混浊。 A:这是正常的。确保在转染吸取液体前混合试剂（颠倒 5 到 10 次） 。LIPOFECTIN 试剂 Q1:未稀释的试剂即混浊。 A1:不要使用。可能已冰冻或在低于 4℃保存。 Q2:试剂稀释后混浊。 A2:这是正常的。未稀释的 LIPOFECTIN 试剂是澄清的。当稀释于 OPTI-MEMⅠ时会变混浊。 Q3:转染效率低。A3: 在加入 DNA 前将 LIPOFECTIN 试剂在 OPTI-MEMⅠ（或其他无血清培养基）中温育 30 分钟。LIPOFECTAMINE 试剂 Q:荧光背景。A:在免疫细胞化学转染后会检测到荧光背景。LIPOFECTAMINE 试剂本身没有荧光。LIPOFECTAMINE PLUSQ1:转染效率低A1:1)试剂的加入顺序不对。 将 DNA 和 PLUS 试剂在稀释培养基中混合，然后将混合液同稀释的 LIPOFECTAMINE 试剂混合。 2): 在复合前稀释的 DNA 或 PLUS 没有充分混合。确保在混合前每孔都混合好。在进行预复合的稀释培养基中加入 DNA 和 PLUS 试剂 的顺序不影响转染活性。 3)没有使用 LIPOFECTAMINE 试剂。 确保在加入到细胞前将 DNA-PLUS 试剂复合物同稀释的 LIPOFECTAMINE 试剂混合并温育。LIPOFECTAMINE 2000Q1:转染效率低。A1:1)对于在 OPTI-MEMⅠ中制备的稀释液，确保稀释的 LIPOFECTAMINE 2000 在 30 分钟内同稀释的 DNA 混合。2)如果使用 D-MEM 做为稀释液，在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合 3)细胞密度对于转染太低。在转染时细胞融合度应为 90%。Q2:复合物溶液混浊。 A2:这是正常的。