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分子生物学与研究方法-DNA-蛋白质相互作用.ppt 24页
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分子生物学与研究方法-DNA-蛋白质相互作用.ppt
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研究DNA与蛋白质相互作用的方法 凝胶阻滞试验方法 凝胶阻滞试验用途 2.6.2 DNasel足迹试验 DNasel足迹试验过程 足迹试验的优点 DNasel足迹试验发展 2.6.3 甲基化干扰试验 甲基化干扰试验的具体操作 甲基化干扰试验的用途 DMS化学干扰的主要局限性 2.6.4 体内足迹试验 体内足迹试验的方法 体内足迹试验优缺点 思考题 * 基因工程 第二章
基因工程技术原理 * 西北师范大学
分子生物学研究的主要方法 生命科学院&分子生物学& 又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相在缩短了。所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。 2.6.1 凝胶阻滞试验 原理 返回目录 返回第二章 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段（亦称探针DNA），然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA一蛋白质复合物。将它加样到非变性的凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离，并应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞层白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标己都将集中出现在凝胶的底部；反之，将会形成DNA一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以有的文献中也称这种试验为条带阻滞试验（band retardation assay）。
鉴定特殊细胞提取物中，是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质分子（比如特异的转录因子等） 研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性：其办法是在DNA一蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA。如果竞争同一种蛋白，由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA处于自由状态，自显影图片上不出现阻滞的条带，相反，如果不竞争同一蛋白，探针DNA仍与特定蛋白复合，呈现阻滞的条带。 使用竞争DNA，可间接阐明体内的DNA与蛋白质的相互作用。如，使用一种具有与已知转录因子结合位点的竞争DNA，就可以判断检测到的蛋白质是否属于此类转录因子，或是与之相关的其它转录因子；如果事先引入突变，可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响。 尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA蛋白质之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部位。要解答这个问题，则需要应用 DNasel足迹试验（footprinting assay）。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。
首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链DNA分子 体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的 DNasel（它可沿着靶 DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNasel消化之后便会产生出距放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。 从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹” 。 可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹试验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核酸序列的
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＞＞＞青霉素是一常用抗生素，研究表明它能够抑制肽聚糖（一种糖类与蛋白..
青霉素是一常用抗生素，研究表明它能够抑制肽聚糖（一种糖类与蛋白质结合的物质）的合成，由此可以判断青霉素能杀死下列哪种生物
A．SARA病毒B．霉菌C．大肠杆菌 D．草履虫
题型：单选题难度：偏易来源：0103
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据魔方格专家权威分析，试题“青霉素是一常用抗生素，研究表明它能够抑制肽聚糖（一种糖类与蛋白..”主要考查你对&&遗传物质&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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遗传物质发现的实验及其内容：1、遗传物质：①概念：能单独传递遗传信息的物质。②遗传物质的主要载体是染色体。③作为遗传物质应具备的特点是：a、分子结构具有相对稳定性；b、能自我复制，保持上下代连续性；c、能指导蛋白质合成；d、能产生可遗传变异。2、实验：包括肺炎双球菌转化实验、艾弗里证明DNA是遗传物质的实验（肺炎双球菌体外转化实验）、T2噬菌体侵染细菌的实验（用分别含有放射性同位素35S和放射性同位素32P培养基培养大肠杆菌。）、烟草花叶病毒的感染和重建实验。实验证明DNA是主要的遗传物质，少部分生物的遗传物质是RNA。（1）肺炎双球菌转化实验：①肺炎双球菌
②肺炎双球菌体内转化实验a、研究者：1928年，英国科学家格里菲思。 b、实验材料：S型和R型肺炎双球菌、小鼠。c、实验原理：S型肺炎双球菌使小鼠患败血病死亡；R型肺炎双球菌是无毒性的。 d、实验过程：e、结论：加热杀死的S型细菌体内含有“转化因子”，促使R型细菌转化为S型细菌。（2）艾弗里证明DNA是遗传物质的实验（肺炎双球菌体外转化实验）：a、研究者：1944年，美国科学家艾弗里等人。b、实验材料：S型和R型肺炎双球菌、细菌培养基等。c、实验设计思路：把DNA与其他物质分开，单独直接研究各自的遗传功能。d、实验过程及分析 e、实验分析：①只有S型细菌的DNA能使R型细菌发生转化。 ②DNA被水解后不能使R型细菌发生转化。 d、实验结论：①S型细菌的DNA是“转化因子”，即DNA是遗传物质。 ②同时还直接证明蛋白质等其他物质不是遗传物质。 （3）T2噬菌体侵染细菌的实验：a、研究着：1952年，赫尔希和蔡斯。b、实验材料：T2噬菌体和大肠杆菌等。c、实验方法：放射性同位素标记法。d、实验思路： S是蛋白质的特有元素，DNA分子中含有P，蛋白质中几乎不含有，用放射性同位素32P和放射性同位素35S分别标记DNA和蛋白质，直接单独去观察它们的作用。 e、实验过程：标记细菌→标记噬菌体→用标记的噬菌体侵染普通细菌→搅拌离心。科学家首先用放射性同位素35S标记了一部分噬菌体的蛋白质，并用放射性同位素32P标记了另一部分噬菌体的DNA，然后，用被标记的T2噬菌体分别去侵染细菌（上图），当噬菌体在细菌体内大量增殖时，生物学家对被标记物质进行测试。f、测试的结果表明，噬菌体的蛋白质并没有进入细菌内部，而是留在细菌的外部，噬菌体的DNA却进入了细菌体内，可见，噬菌体在细菌内的增殖是在噬菌体DNA的作用下完成的。即结论：在噬菌体中，亲代和子代间具有连续性的物质是DNA，即子代噬菌体的各种性状是通过亲代 DNA传给后代的，DNA才是真正的遗传物质。 体内转化实验与体外转化实验的比较：
肺炎双球菌体外转化实验和噬菌体侵染细菌实验的比较：1．实验设计思路比较
&2．两个实验遵循相同的实验设计原则——对照原则3．实验结论比较(1)肺炎双球菌转化实验的结论：证明DNA是遗传物质，蛋白质不是遗传物质。(2)噬菌体侵染细菌实验的结论：证明DNA是遗传物质，不能证明蛋白质不是遗传物质，因为蛋白质没有进入细菌体内。知识点拨：1、上清液和沉淀物中都有放射性的原因分析：①用32P标记的噬菌体侵染大肠杆菌，上清液中有少量放射性的原因： a．保温时间过短，部分噬菌体没有侵染到大肠杆菌细胞内，经离心后分布于上清液中，使上清液出现放射陡。 b．保温时间过长，噬菌体在大肠杆菌内增殖后释放子代，经离心后分布于上清液中，也会使上清液的放射性含量升高。 ②用35S标记的噬菌体侵染大肠杆菌，沉淀物中也有少量放射性的原因：由于搅拌不充分，有少量35S的噬菌体蛋白质外壳吸附在细菌表面，随细菌离心到沉淀物中，使沉淀物中出现少量的放射性。2、关于噬菌体侵染细菌实验中放射性元素的去向问题 ①若用32P和35S标记病毒而宿主细胞未被标记，相当于间接地将核酸和蛋白质分开，只在子代病毒的核酸中有32p标记。②若用32p和35S标记宿主细胞而病毒未被标记，则在子代病毒的核酸和蛋白质外壳中均有标记元素。③若用C、H、O、N等标记病毒而宿主细胞未被标记，则只在子代病毒的核酸中有标记元素。④若用C、H、O、N等标记宿主细胞而病毒未被标记，则在子代病毒的核酸和蛋白质外壳中均可找到标记元素。 3、标记噬菌体时应先标记细菌，用噬菌体侵染被标记的细菌，这样来标记噬菌体。因为噬菌体是没有细胞结构的病毒，只能在宿主细胞中繁殖后代，所以在培养基中它是不能繁殖后代的。4、噬菌体侵染细菌实验只能证明DNA是遗传物质，不能证明蛋白质不是遗传物质，因蛋白质没有进入细菌体内。除此之外，还能证明DNA能进行自我复制，DNA控制蛋白质的合成。5、两个实验都不能证明DNA是主要的遗传物质。 6、细胞生物（包括原核和真核生物）含有两种核酸（DNA和RNA），遗传物质是DNA；病毒没有细胞结构，只有一种核酸（DNA病毒、RNA病毒）。7、DNA有四种碱基（AGCT），四种脱氧核苷酸。RNA有四种碱基（AGCU），四种核糖核苷酸。知识拓展：1、实验设计的基本思路是设法把 DNA和蛋白质分开，单独观察它们的作用。2、加热杀死的S型细菌，其蛋白质变性失活； DNA在加热过程中，双螺旋解开，氢键被打断，但缓慢冷却时，其结构可恢复。3、转化因子的实质是S型细菌的DNA片段整合到了R型细菌的DNA中，即实现了基因重组。4、T2噬菌体（1）结构：（2）T2噬菌体是一种专门寄生在大肠杆菌体内的病毒，它的头部和尾部的外壳都是由蛋白质构成的，头部内含有DNA。T2噬菌体侵染大肠杆菌后，就会在自身遗传物质的作用下，利用大肠杆菌体内的物质来合成自身的组成成分，进行大量增殖。当噬菌体增殖到一定数量后，大肠杆菌裂解，释放出大量的噬菌体。&5、侵染特点及过程①进入细菌体内的是噬菌体的DNA，噬菌体的蛋白质外壳留在外面不起作用。 ②噬菌体侵染细菌要经过吸附→注入核酸→合成 →组装→释放五个过程。 6、增殖特点：在自身遗传物质的作用下，利用大肠杆菌体内的物质合成自身成分，进行增殖。
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DNA-蛋白质的相互作用
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