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如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
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如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
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如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性
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提到序列比对，绝大多数战友都会想到BLAST，但BLAST 的使用确实又是一个很大的难题，因为他的功能比较强悍，里面涉及到的知识比较多，而且比对结束后输出的结果参数（指标）又很多。如果把BLAST 的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得BLAST 的使用。所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST 的使用，也算是BLAST 的入门课程吧。请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后BLAST 的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了。
1．打开BLAST 页面，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 打开后如图所示：
对上面这个页面进行一下必要的介绍：
BLAST 的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是BLAST 的三条途径。 第一部分BLAST Assembled Genomes 就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。 第二部分Basic BLAST 包含了5 个常用的BLAST，每一个都附有简短的介绍。 第三部分Specialized BLAST 是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP 等等，这个时候你就需要在Specialized BLAST 部分做出适当的选择了。
总之，这是一个导航页面，它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST 途径。下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST 的使用，期间我也会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。
2． 点击Basic BLAST 部分的nucleotide blast 链接到一个新的页面。打开后如图所示：
介绍一下上述页面：
Enter Query Sequence 部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列）。Job Title 部分还可以为本次工作命一个名字。Choose Search Set 部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类（genome DNA、mRNA 等等）。如果是人或老鼠的话，就可以直接选择了如果是其他物种就要选择“others”了，这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框，你可以分别选
介绍一下上述页面：Enter Query Sequence 部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列）。Job Title 部分还可以为本次工作命一个名字。
Choose Search Set 部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类（genomeDNA、mRNA 等等）。如果是人或老鼠的话，就可以直接选择了如果是其他物种就要选择“others”了，这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框，你可以分别选 择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。下面的Entrez Query 可以对比对结果进行适当的限制。
Program Selection 部分其实是让我们选择本次比对的精确度，种内种间等等。在BLAST 按钮下面有一个“Algorithm parameters” ，这是参数设置选项，一般用户使用不到此项，所以它比较隐蔽，点击，原网页下方即可增加了Algorithm parameters 的内容。大部分战友都用不到更改这里面的选项，我也不多说了，有兴趣的朋友可以自己研究一下。
3．依次填写上述网页必须部分，点击BLAST 按钮后，出现如下界面（只截取其中一部分）：
出现的这个结果页面信息含量非常大，如果我们用心观察，还是可以发现其中的一些主要指标的。列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。其中Description 部分推荐大家详细看一下，另外说一下“E value” 这个指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度 越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了，还配合着各种参数的得分。
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图文讲解如何用Blast验证引物
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图文讲解如何用Blast验证引物
关注微信公众号Primer-BLAST:NCBI 的引物设计和特异性检验工具 | 分析技能
来源:联川生物技术公司
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还有10天就到圣诞节啦，有么有一丢丢期待小编的礼物呢~哈哈，把你们的袜子准备好就行了，小编今年要充当一回圣诞老人，给大家送去乃们最喜欢的礼物！然鹅，亲爱的小伙伴们喜欢什么呢？能不能偷偷告诉一下小编，好让小编准备准备，快去微信公众号说出你的心声吧！下面就来看看每周的技能分享吧，希望对你有帮助~一、Primer-BLAST 介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（ PCR）的特异性寡核苷酸引物。 Primer-Blast 可以直接从Blast 主页（ ）找到，或是直接用下面的链接进入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的 Primer软件（一种引物设计软件），再加上NCBI的 Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用 Blast 进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST 能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。 Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer 和 NCBI BLAST 更加准确。二、Primer-BLAST 输入Primer-BLAST 界面包括了 Primer 和 BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分： target template（模板区） , the primers（引物区） , 和 specificity check（特异性验证区）。跟其它的 BLAST一样，点击底部的“ Advanced parameters”有更多的参数设置。1、模板（ Template）在“ PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列， FASTA 格式或直接用 Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。 Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check 区选择）是唯一的。 2、引物（ Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check 区选择）。根据需要可设置产物的大小， Tm 值等。3、特异性（ Specificity）在 specificity check 区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了 4 种数据库： RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用 NCBI 的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时， Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow,dog, chicken,zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。 Nr 数据库覆盖 NCBI所有的物种。三、实例分析用人尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。 UNG1 的序列长一点（ NM_003362）， UNG2 的序列短一点（ NM_080911，注：拿这两个基因的序列 ClustalW 一下就可以了）。这里用 UNG2 的序列设计引物，选择 RefSeq mRNA database，物种是 Human，其它默认。结果如下图 A-B 所示，设计的引物只能扩增出 UNG2。看上面的图，把“ Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的结果如下图C 所示，新的引物也可以扩增出 UNG1。
四、Tips1，在任何时候都要优先使用参考序列的 Gi 号或 Accession 号（尽量不要使用 Fasta 格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填 Accession Number 时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession号（Primer-BLAST 有参数可以设置设计引物的范围，” Form-To”，如上面的第一幅图所示）。因为用Gi号或Accession号， NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。3，尽量使用没有冗除的数据库（如 refseq_rna 或 genome database）， nr 数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。
4，请指定一个或几个 PCR 扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。好啦~今天的技能分享就到这里啦，更多技能分析内容请关注微信公众号查看。我们下期再见哦~记得来领你的圣诞礼物哦~欢迎转载，请注明出处：本文转载自联川生物公众号lncRNA报告全新升级，快来接招！微信公众号回复“报告升级”，即可查看哦~
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