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从RNA提取到荧光定量PCR解决方案-RNA提取和RT
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&&real time pcr和RNA提取的 技术原理,及实验条件优化,相关问题解决。
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【交流】血清中RNA提取的步骤及问题，请高手帮忙分析！急！急
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这个帖子发布于5年零132天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
1. TRIzol LS（Invitrogen）：血清=体积比3:1，涡旋混匀，冰中静止10min，（TRIzol LS的体积定义为V）；2.加入4/15V体积的氯仿，涡旋混匀30s，置于冰中，10min。3.离心，14000rpm，15分钟，4°。4.轻轻取出离心管，吸取上清，移入新的离心管，避免白色中间层吸入。5.异丙醇，实验开始时，-20°冻存，取出，加入2/3V异丙醇，轻轻混匀，-20°，静止15min。6.取出离心，14000rpm，10分钟，4°.7.轻轻倾倒，去液体。（原理上，本步骤应见沉淀，但本人从未见到沉淀）；8.加入4/3V的75%的乙醇，混匀，离心。8000rpm，5min，4°。9.取出，去液体，置于空气中5min中。10.加入20ul的DEPC水稀释。11.Nanodrop 测浓度。全过程完。现在问题来了：1、提取200ul血清，稀释到20ul，浓度为200ng/ul，且OD值在1.45-1.6之间。与其提取比较，本人提取的浓度过高，OD值偏低，且在A230处有双峰。2、以3ul上样，1.5%的琼脂糖电泳，未见条带。这是为什么，急切的想请高手帮帮忙！拜求了！！！！
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我平时提取也是200ul血清，以前trizol和血清体积一样，后来感觉血清中白蛋白过多，裂解不充分就加1ml trizol，其实200ul~1ml都可以，然后加入1/5 总体积的氯仿，涡旋血清至完全成乳白色没有结块，静止3~5min，12000g 4℃ 15min离心，吸取上清，加等体积的异丙醇，过夜沉淀。然后12000g 4℃ 10min ，弃上清，75%酒精（DEPC水配制）1ml洗涤沉淀，7500g 4℃ 5min 离心，晾干沉淀（不要太干，没有太多液体就行了），20ul DEPC水溶解。 大致就这么多了。 希望对你能有帮助。
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我们也一直用Trizol提取血清中的RNA，但步骤和你的差别很大。一般溶解到20ulDEPC水中，浓度在几十不会超过100ng/ul，如果浓度很高原因可能是：你提取的过程有问题，还有可能是血清处理问题。由于血清中RNA多是游离的胞外RNA，包括一些mRNA，sncRNA，miRNA等，量少，浓度低，所以260/280不准确，但一般在1.3以上可以接受，由于都是小RNA，所以跑电泳的时候不会看到3条带，看不到条带。230处有双峰说明盐离子污染严重。胍盐残留，氯仿没处干净。还有你的转速太大了，也可能把盐离子沉淀下来，一般12000g就行了。还有就是异丙醇沉淀时间太短，血清中都是小RNA，不易沉淀，一般加0.6V的异丙醇过夜沉淀，7~8个小时比较好。
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异丙醇0.6~1.2胍盐残留蛋白残留
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我们也一直用Trizol提取血清中的RNA，但步骤和你的差别很大。一般溶解到20ulDEPC水中，浓度在几十不会超过100ng/ul，如果浓度很高原因可能是：你提取的过程有问题，还有可能是血清处理问题。由于血清中RNA多是游离的胞外RNA，包括一些mRNA，sncRNA，miRNA等，量少，浓度低，所以260/280不准确，但一般在1.3以上可以接受，由于都是小RNA，所以跑电泳的时候不会看到3条带，看不到条带。230处有双峰说明盐离子污染严重。胍盐残留，氯仿没处干净。还有你的转速太大了，也可能把盐离子沉淀下来，一般12000g就行了。还有就是异丙醇沉淀时间太短，血清中都是小RNA，不易沉淀，一般加0.6V的异丙醇过夜沉淀，7~8个小时比较好。
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mengzhu8781 我们也一直用Trizol提取血清中的RNA，但步骤和你的差别很大。一般溶解到20ulDEPC水中，浓度在几十不会超过100ng/ul，如果浓度很高原因可能是：你提取的过程有问题，还有可能是血清处理问题。由于血清中RNA多是游离的胞外RNA，包括一些mRNA，sncRNA，miRNA等，量少，浓度低，所以260/280不准确，但一般在1.3以上可以接受，由于都是小RNA，所以跑电泳的时候不会看到3条带，看不到条带。230处有双峰说明盐离子污染严重。胍盐残留，氯仿没处干净。还有你的转速太大了，也可能把盐离子沉淀下来，一般12000g就行了。还有就是异丙醇沉淀时间太短，血清中都是小RNA，不易沉淀，一般加0.6V的异丙醇过夜沉淀，7~8个小时比较好。您也是做microRNA的吧，我还有想请教一下，您逆转录用多少ng的RNA为模板啊，用加尾法还是颈环法？
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我平时提取也是200ul血清，以前trizol和血清体积一样，后来感觉血清中白蛋白过多，裂解不充分就加1ml trizol，其实200ul~1ml都可以，然后加入1/5 总体积的氯仿，涡旋血清至完全成乳白色没有结块，静止3~5min，12000g 4℃ 15min离心，吸取上清，加等体积的异丙醇，过夜沉淀。然后12000g 4℃ 10min ，弃上清，75%酒精（DEPC水配制）1ml洗涤沉淀，7500g 4℃ 5min 离心，晾干沉淀（不要太干，没有太多液体就行了），20ul DEPC水溶解。 大致就这么多了。 希望对你能有帮助。
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陈沫518 您也是做microRNA的吧，我还有想请教一下，您逆转录用多少ng的RNA为模板啊，用加尾法还是颈环法？模板是400~500ng左右，我们是用颈环引物反转录的。
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请求兄发一个完整的操作步骤上来，最近我也要提取血清中的RNA，以前没做过，心里没底呀！多谢了！
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mengzhu8781 模板是400~500ng左右，我们是用颈环引物反转录的。请问你的血清提的浓度和纯度都还好么，我用的是加尾法，目的和内参ct值都30多，cdna 模板用500ng,如何解释
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HaveNoMoney 请求兄发一个完整的操作步骤上来，最近我也要提取血清中的RNA，以前没做过，心里没底呀！多谢了！不好意思，好久没来了，大致步骤：200ul血清，以前trizol和血清体积一样，后来感觉血清中白蛋白过多，裂解不充分就加1ml trizol，其实200ul~1ml都可以，然后加入1/5 总体积的氯仿，涡旋血清至完全成乳白色没有结块，静止3~5min，12000g 4℃ 15min离心，吸取上清，加等体积的异丙醇，过夜沉淀。然后12000g 4℃ 10min ，弃上清，75%酒精（DEPC水配制）1ml洗涤沉淀，7500g 4℃ 5min 离心，晾干沉淀（不要太干，没有太多液体就行了），20ul DEPC水溶解。
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补充一点，沉淀小RNA时候，最好在-20度，时间一小时以上，效果会好
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zhangping2010 请问你的血清提的浓度和纯度都还好么，我用的是加尾法，目的和内参ct值都30多，cdna 模板用500ng,如何解释
不好意思，还就没来了。血清中的RNA测浓度时通过260/280的值推测其纯度本来就是不可信的，因为RNA浓度很低，测得不够准确。但参考值是：260/280大于1.6，吸收峰值一般都在270左右的。
我说的cDNA浓度时组织里提取的，血清中提取的RNA我们一般选择30ng为模板进行荧光定量的。我们的Ct值在28左右，不影响，因为我们做的是相对定量，主要看内参的Ct值。
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mengzhu8781
不好意思，还就没来了。血清中的RNA测浓度时通过260/280的值推测其纯度本来就是不可信的，因为RNA浓度很低，测得不够准确。但参考值是：260/280大于1.6，吸收峰值一般都在270左右的。
我说的cDNA浓度时组织里提取的，血清中提取的RNA我们一般选择30ng为模板进行荧光定量的。我们的Ct值在28左右，不影响，因为我们做的是相对定量，主要看内参的Ct值。谢谢。我的内参现在一般是25个循环左右，应该没问题了吧，目的基因28-35个循环，260/280还是1.0左右，峰值在270位置，40ng左右的RNA可逆转出的cDNA为880多ng/ul，应该可以继续往下做了不
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不好意思，还就没来了。血清中的RNA测浓度时通过260/280的值推测其纯度本来就是不可信的，因为RNA浓度很低，测得不够准确。但参考值是：260/280大于1.6，吸收峰值一般都在270左右的。
我说的cDNA浓度时组织里提取的，血清中提取的RNA我们一般选择30ng为模板进行荧光定量的。我们的Ct值在28左右，不影响，因为我们做的是相对定量，主要看内参的Ct值。我的内参U6是ct值为32-33，mir-16为28-29，很奇怪。我用的是加尾法！
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请问各位侠客，从血清中分离rna,你们从全血中分离出血清是怎么弄得，具体点，我看好多地方的分离方法不一样，这个分离血清的方法有没有比较统一的方法？谢谢各位啊，急求
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我用的TRIZOL LS加上QIAMP的RNEASY MINI KIT，可还是提不好~不知道哪提错了！！
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500UL血浆+1000uL TRIZOL LS 然后放置10min后加入200ul氯仿--离心差不多吸取500ul上清加入500ul 70%乙醇（我也加过无水乙醇），转移到离心柱中--离心然后按照KIT说明书做，后面没提出来，问下你们的方法是什么呢？
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,用试剂盒吧，效果比TRIZOL沉淀法的好。tanbo110 500UL血浆+1000uL TRIZOL LS 然后放置10min后加入200ul氯仿--离心差不多吸取500ul上清加入500ul 70%乙醇（我也加过无水乙醇），转移到离心柱中--离心然后按照KIT说明书做，后面没提出来，问下你们的方法是什么呢？
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陈沫518 我的内参U6是ct值为32-33，mir-16为28-29，很奇怪。我用的是加尾法！请教，加尾法能用U6做内参吗？U6是snRNA，加尾法应该是只针对miRNA的吧
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tanbo110 500UL血浆+1000uL TRIZOL LS 然后放置10min后加入200ul氯仿--离心差不多吸取500ul上清加入500ul 70%乙醇（我也加过无水乙醇），转移到离心柱中--离心然后按照KIT说明书做，后面没提出来，问下你们的方法是什么呢？怎么没见你用异丙醇沉淀呢？？
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陈沫518 怎么没见你用异丙醇沉淀呢？？后面用无水乙醇和异丙醇提取出来了，大概30nG/ML
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tanbo110 后面用无水乙醇和异丙醇提取出来了，大概30nG/ML30ng/ml ，这浓度是不是太低了？？你提了多少微升的血啊？
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陈沫518 30ng/ml ，这浓度是不是太低了？？你提了多少微升的血啊？我的意思是提取一毫升血浆，RNA计算出来总量是30ug左右
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血清提取还是用试剂盒比较好，trizol的话损失会比较多，如有问题可咨询QQ：
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mengzhu8781 我平时提取也是200ul血清，以前trizol和血清体积一样，后来感觉血清中白蛋白过多，裂解不充分就加1ml trizol，其实200ul~1ml都可以，然后加入1/5 总体积的氯仿，涡旋血清至完全成乳白色没有结块，静止3~5min，12000g 4℃ 15min离心，吸取上清，加等体积的异丙醇，过夜沉淀。然后12000g 4℃ 10min ，弃上清，75%酒精（DEPC水配制）1ml洗涤沉淀，7500g 4℃ 5min 离心，晾干沉淀（不要太干，没有太多液体就行了），20ul DEPC水溶解。 大致就这么多了。 希望对你能有帮助。常温离心可以吗？
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陈沫518 我的内参U6是ct值为32-33，mir-16为28-29，很奇怪。我用的是加尾法！你好，请问你用的加尾法上游引物是如何设计的？
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zhangping2010 谢谢。我的内参现在一般是25个循环左右，应该没问题了吧，目的基因28-35个循环，260/280还是1.0左右，峰值在270位置，40ng左右的RNA可逆转出的cDNA为880多ng/ul，应该可以继续往下做了不我想我问一下您当时做血清的RNA用的什么内参呢？内参的CT值是多少
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楼主你好，我用trizol ls提取的血清RNA浓度在50ng/ul左右，准备用茎环法做RT-PCR，protocal上是RNA1ug进行逆转录，我提取的RNA只有最多只有500ng，想请教一下是否可以将RNA，引物和Mix按照等比例减量，RNase-free水加到10ul进行逆转录？如果可以RNA最少可以是多少？
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关于丁香园在进行高通量药物筛选，干细胞或胚胎细胞等研究时，经常需要对单个细胞或数百个细胞的微量样本进行分析，这时，以上几种常规纯化方式均很难完整地保存RNA信息。直接裂解细胞是获得少量细胞RNA的最好方法，不经介质吸附洗脱过程，无RNA损失。这就需要裂解液即可迅速裂解细胞，高效的保护RNA，又不会影响高效反转录反应，且对于后续荧光定量PCR无抑制作用。 FastLine细胞到cDNA快速制备试剂盒（KR105，TIANGEN），一站式完成从细胞到cDNA的快速制备，同时去除基因组DNA残留，整个操作流程仅需50 min，获得的cDNA不但可以直接进行荧光定量 PCR还可以和正常提取RNA后进行第一链反转录后得到的cDNA一样，冷冻保存供以后使用，是从少量细胞快速制备cDNA的最佳选择，并可实现高通量检测。&高质量cDNA应具备信息完整性好和浓度高的特点
cDNA的信息完整性和浓度是由RNA的质量和反转录效率所共同决定的。
1.&高质量的RNA模板是获得高质量cDNA的首要条件，应具备纯度高（不含抑制剂）和完整性好的特点，纯度高可保证不对后续反转录反应产生抑制作用，完整性好才可保证cDNA的信息完整性。下面具体介绍一下RNA质量的评价标准：
1)&RNA纯度评价一般采用紫外分光光度计对RNA纯度进行评价，例如Nanodrop。OD260/OD280＝1.9 ～2.1，代表高纯度的RNA；OD260/OD280 & 1.9，表明有蛋白质残留；OD260/OD280 & 2.1，表明RNA有部分降解，可经琼脂糖凝胶电泳进一步确定；OD260/OD230 & 2.0,表明有盐离子残留。注意：如用RNase-Free H2O溶解RNA，会导致OD260/OD280值偏低，但不影响RNA的质量。此方法不能反映基因组DNA的残留情况，需进行琼脂糖凝胶电泳进一步鉴定。
2)&RNA完整性评价一般可通过常规琼脂糖凝胶进行完整性和质量评价。真核生物的28S和18S rRNA电泳条带明显，且比率接近2：1，表明RNA完整性好，没有降解。另外，此方法亦可反映出严重的基因组DNA残留和蛋白残留情况，但痕量的基因组DNA残留无法被检测出来，却会影响灵敏度极高的荧光定量PCR实验结果。
2.&高效反转录酶是获得高质量cDNA的必要条件，理想的反转录酶应具备反转录效率高，RNase H活性低，复杂模板通读能力强和操作便捷等特点，目前市场上的逆转录酶分为以下三代：
1)&第一代是AMV，它来源于禽成髓细胞瘤病毒，由于其两个游离肽键的特性，其反转录性能可以达到50-60%，但是，其具有RNase H活性，能够降解反转录反应中模板RNA，当进行较长片段的反转录时，就会造成cDNA的信息不完整。
2)&第二代是M-MLV，来源于Moloney鼠白血病病毒，它大大降低了RNase H的活性，但仅有一个游离肽键，所以反转录效率仅为30-40%，需要较大量的RNA模板，这样，与高丰度RNA的竞争会导致低丰度RNA的反转录效率更低，使cDNA无法反映样本真实的转录情况，甚至因检测灵敏度过低而导致实验失败。
3)&由于前两代酶的不理想，以TIANGEN的Quant系列为代表的第三代酶在市场上显现出了很强的增长势头。Quant是大肠杆菌重组酶，具有90%的革命性反转录效率，使RNA基本完全转录为cDNA，保证了低丰度RNA的检测灵敏度；完全不具有RNase H活性，保证了cDNA的信息完整性，并且具有革命性的复杂模板通读能力，可对高GC含量的RNA进行高效逆转录；另外，还在操作简便性上有了革命性的变化，是目前市场上最优质的反转录酶。
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实时荧光定量PCR专辑
东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月综述METHODS 25, 383C385 (2001) doi:10.1006/meth., available online at http://
on实时荧光定量 PCR Thomas D. Schmittgen Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, WA 99164.对于从 90 年代初就开始接触定量 PCR 的实验人员来说，他们早已对繁琐的定量方法习以为常。早期定量 PCR 技 术的难点主要在于： （1）如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内（只有在此范围内 PCR 产物信号才与初始模板的拷贝 数成比例）（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系 。 列梯度稀释的 cDNA(1)或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整(2)；有的研究者加一个竞争性模板(3)，有的做限制性 的稀释梯度分析(4)，或者加一个 PCR 模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增(5)。而扩增产物的检测通 常在跑胶以后通过染料，放射活性或者探针进行检测。 对于已经开始使用实时定量 PCR 的研究者来说，过去的日子已经一去不复返了。在实时 PCR 中，不再需要担心 扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据。现在在 2 到 3 小时之内拿到数据已经不再是梦想。除此 之外，实时 PCR 还有其它的一些优点：灵敏度大大提高；可以实现高通量；所有实验在封闭系统内完成，可变因素大 大减少；可以进行多重 PCR 反应，而且不需要后期处理。 PCR 实时检测技术从诞生到现在已经有五年了，但是其应用在近两年才开始迅猛增长。在 Medline 数据库中，用 “Taqman”或“real-time and PCR”作为关键词搜索，在 1996 年有 19 篇文章，在 1997 年有 28 篇文章，在 、 2000 年文章数分别达到了 52、157 和 409 篇。在这篇文章写作的同时，在 2001 年已经可以找到 551 篇文章了。许多 厂商也正在大力宣传实时荧光定量 PCR 仪及其相关的技术（包括软件、探针等） ，而且在不久的将来，会有更多的产 品发布。针对实时定量 PCR 这一热点领域，我们收集了许多目前用实时定量 PCR 来定量 DNA 或 RNA 的方法，汇编 成 9 篇文章，涵盖了从 mRNA 和病毒 DNA 定量到 DNA 的甲基化和单核甘酸多态性的扩增检测。 Giulietti等人描述了通过实时PCR对cytokine基因表达进行定量的方法。因为这一类基因在免疫的诸多方面都起着 非常重要的作用，读者会发现这篇文章非常有用，特别是文中列出了许多cytokine基因和看家基因的引物和探针序列。 就象大多数方法一样，这篇文章描述的定量检测cytokine基因表达的方法可以外推检测许多不同种类的mRNA。同时这 篇文章也对实时定量PCR做了一个很好的综述，包括探针的化学原理和仪器介绍。我们推荐这个领域的所有新手应该 先读读这篇文章。 对于 DNA 或 RNA 的常规定量来说， 有两种定量方法： 绝对定量和相对定量。 绝对定量检测模板数的精确拷贝数， 通常要用到标准曲线。在 Niesters 的文章里讨论了绝对定量用于病毒载量分析的方法。而相对定量能给出样本间基因 表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。通常，给出基因表达的相对变化就足够说明问题了，并不需 要给出绝对量的变化。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时。对于那些想得到相 对表达数据的研究者来说，Livak 和 Schmittgen 文章中的公式对于数据分析是非常有用的。这篇文章描述了 2-ΔΔCT 方 法的推倒、假设和 2-ΔΔCT 在基因相对表达分析中的实际应用。文章中也讨论了 2-ΔΔCT 方法的两种衍生方法，以及数据1东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月分析的一些小窍门。包括表格设计等。Lehmann and Kreipe 等人在他们的文章中将 2-ΔΔCT 方法用于病人标本的定量研 究。 cDNA 芯片和差异显示是两种最常用的高通量筛选基因表达差异的技术。这两种技术的缺点在于它们只是定性而 非定量分析，因而需要用一个定量的方法确认基因表达的差异，而实时 PCR 就是非常合适的一种手段。Rajeevan 等人 的文章描述了一种利用 SYBR-Green I 通过实时 PCR 检测产物并进行熔解曲线分析的方法，并用该方法对 cDNA 芯片 和差异显示 PCR 技术的结果进行了确认。将实时 PCR 和高通量方法的结果相互比较就能对这个基因是否真的存在表 达差异进行确证。 相对于 Taqman 探针而言， SYBR-Green I 更高的灵活性使其被用于高通量筛选出的基因的快速确证。 另一个实时 PCR 方法应用的例子是 DNA 甲基化的检测。CG 岛内胞嘧啶的甲基化形成 5’-甲基胞嘧啶被认为和许多人 类疾病特别是癌症有关。Laird 和他的合作者使用了一种被称作 Methylight 的技术。Methylight 是一种基于 Taqman 探 针的甲基化特异实时 PCR 技术。在扩增之前，DNA 经重硫酸纳处理，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞 嘧啶不受影响。 特异的引物和 Taqman 探针被用来区分甲基化和非甲基化的 DNA。 和其它实时 PCR 方法一样， Methylight 无需电泳，因而提高了反应的灵敏性和通量。这种方法的灵敏性在食道癌病人血液中癌细胞异常甲基化的 DNA 检测 。 中被证明（6） 实时 PCR 可以分辨点突变，已经被广泛应用于遗传分析。Sevall 描述了一个直接用实时定量 PCR 区分等位基因 的方法。有不同的荧光报告基团标记的 Taqman 探针分别与野生型和突变基因杂交。探针杂交的效率和其后的切除与 杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种则说明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表明是一个 杂合子。实时定量 PCR 的数据被标在 xy 坐标轴上来区分特异的基因型。利用这种方法，能在不到两个小时内很快对 96 个样本进行基因分型。 另一个核酸定量的重要应用领域是活体切片检查。世界各地的病理系都储存有大量的福尔马林固定和石蜡包埋的 活体切片。过去如何利用这些活体切片存在许多困难，包括抽提核酸（特别是 RNA） ，在切片中分离特定组织（如癌 症组织和正常组织） 。正如 Lehmann 和 Kreipe 文章中所讨论的，激光显微切片技术结合实时 PCR 技术很大程度上提高 了在福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片中进行常规分析的能力。文章讨论了各种实验室不同的固定条件对核酸扩增 的影响。读者会从文中找到许多有用的实验方法：包括从固定液的组成，最佳的固定条件以及激光辅助显微解剖技术。 同时文章也讨论了如何在福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片中进行 DNA 甲基化分析的方法。 实时 PCR 不仅仅增强了我们进行常规定量分析的能力，也提高了我们高通量筛选的能力。一个明显的例证是实时 PCR 和分子信标的结合正在成为检测单核苷酸多态性的的新方法。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易 感性或者个体对特定的药物的不同反应有着重要的意义。Mhlanga 和 Malmber 在文章中，对用分子信标实时检测 SNP 的技术和方法做了很好的综述。分子信标是双标记的荧光探针，由两个部分组成：一个环状区与目标序列完全配对， 一个自身配对的茎区。在环区和目标序列配对之前，荧光被淬灭基团淬灭。一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种 技术进行高通量的 SNP 检测将会变的简单而准确。引物或分子信标设计的方法和原则、反应条件、数据分析在文章中 都有详细的讨论。文章中还包括了一个用分子信标检测雌激素受体的特异性等位基因的例子。 在同一反应中同时检测多种 PCR 产物（如多重 PCR）已经有 10 年了。在传统的多重 PCR 反应中，不同的扩增产 物通过在胶中不同的迁移速率进行检测(7)。Wittwer 等人描述了实时多重 PCR 的方法和应用。这个实验是在一个快速 循环的 PCR 仪的玻璃毛细管中进行的．它只采用了一个荧光探针，而不是两个荧光探针。多重 PCR 可以通过检测不 同颜色或温度或者同时检测颜色和温度来区分。随着技术的进步，现在已经能在多重 PCR 反应中同时检测四种颜色。 将温度和颜色组合，实时 PCR 可以检测每个反应中高达 12 个的产物。在这篇文章中，多重实时 PCR 被用在了等位基 因检测和突变筛选中。2东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月准确的对动植物或者是人中病毒感染的细胞进行定量无疑是很重要的。这个领域发展非常快，而实时PCR在其中 扮演了一个很主要的角色。Niesters描述了用实时PCR定量病毒载量的方法。这篇文章也是讨论实时PCR是否能用于常 规诊断的文章之一。在文章中给出了DNA和RNA病毒检测的方法步骤。在这篇文章中也讨论了所谓的NASBA技术 （nucleic acid sequence-based amplification） ，它是一种等温的RNA扩增反应，初始RNA被扩增成与模板互补的RNA， 而分子信标被用来检测这种RNA，这其中没有任何背景DNA的扩增。这种方法对反转录病毒的定量特别有用。文章还 包括了关于标准曲线和准确性的讨论以及不同实验室在定量病毒载量时是否需要内标的讨论。 PCR 技术在 80 年代中期出现后，又有许多技术上的新发展。在实时 PCR 出现之前的所谓定量 PCR，需要特别的 训练、严格的测试和特别准确的加样。而实时 PCR 的出现使得科学家能用一个相对直接的方法研究许多基本而重要的 问题。同时实时 PCR 作为常规诊断的手段虽然还有许多困难需要克服，但已经被确立。实时 PCR 在短时期内迅速崛 起，它的诸多优点使得旧的实验方法被打入冷宫。虽然我们还会记起那些老的实验方案，但毫无疑问，它们以后再也 用不上了。参考文献 1. 2. 3. 4. 5. 6. Horikoshi, T., Danenberg, K. D., Stadlbauer, T. H., Volkenandt, M., Shea, L. C., Aigner, K., Gustavsson, B., Leichman, L., Frosing, R., Ray, M., et al. (1992) Cancer Res. 52, 108C116. Kinoshita, T., Imamura, J., Nagai, H., and Shimotohno, K. (1992) Anal Biochem 206, 231C235. Gilliland, G., Perrin, S., Blanchard, K., and Bunn, H. F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, . Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., and Morley, A. A. (1992) Biotechniques 13, 444C449. Chen, C. Y., Del Gatto-Konczak, F., Wu, Z., and Karin, M. (1998) Science 280, . Kawakami, K., Brabender, J., Lord, R. V., Groshen, S., Greenwald, B. D., Krasna, M. J., Yin, J., Fleisher, A. S.,Abraham, J. M., Beer, D. G., Sidransky, D., Huss, H. T., Demeester, T. R., Eads, C., Laird, P. W., Ilson, D. H., Kelsen, D. P., Harpole, D., Moore, M. B., Danenberg, K. D., Danenberg, P. V., and Meltzer, S. J. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92, . 7. Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., and Vogt, P. (1997) Biotechniques 23, 504C511.3东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月实时荧光定量 PCR 技术简介实时荧光定量 PCR 技术原理与应用聚合酶链式反应( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的 方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是 定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。 例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而 实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通 过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图(如图 1)。图1实时荧光扩增曲线图一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧 光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不 再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择 在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈 值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但 一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）（如图 2 所示）。CT值 阈值线图 2. 荧光定量标准曲线4东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越 多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 3 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。图 3 阈值线和 CT 值 荧光探针和荧光染料 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种， 探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产 物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特 异性更高，但后者则简便易行。 1．SYBR Green I SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其 用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应 体系中， 加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后， 发射荧光信号， 而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。图 4. SYBR GREEN I 工作原理5东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别 定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分 析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一 个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升 高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响 1。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。 2．分子信标（molecular beacon） 分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧 光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂， 这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于”黑色” 淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光 形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中， 环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接 在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成 茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团 被激发时，它发出自身波长的光子（图 5）。图 5. 分子信标工作原理6东胜创新技术通讯3．TaqMan 探针Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设 计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’末端，而淬灭剂则在 3’末端。当完整 的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与 扩增产物的数量呈正比关系。图 6. Taqman 探针工作原理7东胜创新技术通讯4. LUX PrimersEastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月LUX (light upon extention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断 的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（如图 7）。图 7.LUX 引物工作原理 与 Taqman 探针和分子信标相比，LUX 引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的 探针序列。因为 LUX 引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。 实时荧光定量 PCR 技术的应用 实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA、RNA 样品进行定量和 定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对 不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如利 用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。目 前实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集 中在以下几个方面： 1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基 因失活率的检测等。 2. 基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )， 特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证 3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。 随着实时荧光定量 PCR 技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。8东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月基因组 DNA 定量MJ Research Incorporated Application Note Vol.1, No.1利用 SYBR-GreenI 染料和 DyNAzymesII 聚合酶对基因组 DNA 进行实时定量分析 Mimi Amutan and David Batey, Ph.D.摘要 本研究对λ噬菌体和人类基因组 DNA 进行定量，扩增反应使用 DyNAzymesII 聚合酶，检测使用 SYBR-GreenI染料。实验中检测了起始拷贝数范围为 102 至 108 的λ噬菌体 DNA 和起始拷贝数范围为 75 至 7.5x104 的人类基因组 DNA。 λ噬菌体 DNA 模板四个重复样品 C(t)标准偏差小于 0.3 个循环说明了检测的准确性。 实验证明使用 DyNAzymesII 聚合酶和 SYBR-GreenI 染料对基因组定量是准确而可靠的。 简介 使用实时定量方法有效的对生物样品中的 DNA 和 RNA 定量。定量的试剂包括与 DNA 双链结合的荧光染料和 TaqMan 探针、分子信标等特异性的杂交探针。与 DNA 双链结合 SYBR-GreenI(SGⅠ)染料因使用简单而被许多定量实 验采用。 SGⅠ是一种特异结合双链 DNA 的染料，已被证明能灵敏的检测核酸。SGⅠ结合双链 DNA 后荧光增强 1000 倍左 右，极为适合检测 PCR 扩增产物。由于 SGⅠ能结合于所有双链，因而不能特异性的检测某一特定模板。使用杂交探 针要求细心设计引物组，而 SGⅠ仅需要两个用于扩增的引物，无需对其进行标记。 DyNAzymesII 聚合酶在多种扩增反应中产生了很好的结果。 这种由 Thermus brockianus 中分离出来的聚合酶比 Taq 酶热稳定性更好，能在广泛的反应条件下保持很好的活性。SGⅠ对 DyNAzymesII 聚合酶的抑制作用更小。本研究的 实时定量 PCR 结果表明使用 DyNAzymesII 聚合酶和 SGⅠ能够精确灵敏的检测到λ噬菌体和人类基因组 DNA 的初始 浓度。 方法 DyNAzyme II DNA 聚合酶购于 Finnzymes (F-503L)。SGⅠ和λ噬菌 DNA购于Molecular Probes (S-7567, P-7589); 人基因组DNA购于Sigma (D-3160).反应液加入低缘微孔板 (MJ Research MLL-9651)或八连管(MJ Research TLS-0251)， 用超净管盖封闭(MJ Research TCS-0803)，反应体系如表1所示。9东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月SGⅠ原液通常为高浓度(e.g.10,000X).表中使用的SGⅠ为10X SGⅠ，OD值在495nm为0.4+0.01O.D.。SGⅠ用0.1X TE缓冲液稀释至10X工作液。 扩增λ噬菌体DNA的引物序列如下（扩增产物100bp）： 正向引物：5’-GCA-AGT-ATC-GTT-TCC-ACC-GT-3’, 反向引物：5’-TTA-TAA-GTC-TAA-TGA-AGA-CAA-ATC-CC-3’ 扩增人类基因组中β-actin基因的引物如下（扩增产物294bp）： 正向引物：5’-TCA-CCCACA-CTG-TGC-CCA-TCT-ACG-A-3’ 反向引物：5’-CAG-CGGAAC-CGC-TCA-TTG-CCA-ATG-G-3’ 反应液混合后将反应管或反应板放入定量PCR仪中，按照表2所列的程序进行扩增反应。阈值线设定为最初的3－7个循环荧光值标准偏差的10倍。这一阈值自动的应用于所有的孔，使得在该点处对标准 品和样品比较产生一致的结果。在任何实验中，标准品和样品的阈值线设定相同十分关键。 以0.5?g/?Lλ噬菌体基因组DNA为母液制备浓度梯度样品。在20?L的反应体系中分别加入1?L各稀释度的样品制作 标准曲线。用来源于人类胎盘的人基因组DNA制备浓度梯度样品，制作标准曲线。 结果 1．λ 噬菌体基因组 DNA 模板：线性范围与重复性 将荧光信号对循环数作图(Figure 1a)表明每一个样品中双链DNA的浓度都升高到了背景荧光水平之上，并且都进 入了指数扩增期。C(t)值（荧光曲线与域值线交叉的点）随着初始模板浓度的增加而成比例的减少，这是因为初始模 板浓度高的样品更快的生成足以被SGⅠ检测到的数量的扩增产物。λ噬菌体基因组DNA初始模板拷贝数的线性范围从 102到108，起始模板浓度的对数与对应的C(t)值成正比。Figure 1b展示的是100bp的扩增产物起始模板浓度的对数与对 应C(t)值的关系图，回归系数为0.991，表明了极强的线性关系。 对每一个浓度的样品，我们都做了四个重复，通过计算C(t)值的差异来验证检测的准确性。如Table 3中所示，重 复样品间C(t)的标准偏差小于0.3。10东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月Figure 2 显示了104拷贝的λ噬菌体DNA四个重复样品的熔解曲线。随着温度的升高与双链接连结合的SGⅠ释放， 荧光信号也随之平滑的下降。荧光强度随温度变化的负一次倒数也被显示。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）处清晰 地看到了一个单一的峰，大约是在82°C。这个峰对应着扩增产物的熔解温度，表明扩增产物为目的产物。荧光强度随 温度变化的负一次倒数图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和假阳性 现象。11东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月2．人基因组 DNA 模板：使用标准曲线对患者样品定量 Figure 3是由人类基因组DNA得到标准曲线，起始拷贝数范围为75至7.5x104，回归系数 r2=0.993。同时检测了两 位患者的基因组DNA样品。对照标准曲线，第一位患者样品的初始拷贝数浓度为254copies/?L,第二位患者样品的初始 拷贝数浓度为357copies/?L.PCR产物的特异性通过两种方法确定。 第一种方法为熔解曲线分析， 例如， 患者样品1的熔解曲线分析显示在88.5°C 时有一个单一的峰，表明特异的扩增了β-actin，如Figure 4所示。第二种方法是通过凝胶电泳分析PCR产物。如Figure 5所示每一个标准品和样品都仅有一个电泳条带，表明了除了少量引物二聚体外，特异性的扩增到目的产物。12东胜创新技术通讯讨论Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月1．对于 λ 噬菌体基因组和人基因组 DNA 都有很宽的线性范围 使用DyNAzyme II DNA聚合酶和SYBR Green I染料可以成功地对小基因组和复杂的人类基因组进行定量。实验表 明至少6个数量级的λ噬菌体基因组DNA和至少3个数量级的人基因组DNA的起始模板浓度对数值与对应的C(t)值曲线 图显示出很好的线性关系。检测线性范围广的特点使其在检测未知浓度的DNA样品和浓度范围广泛的样品时极具价 值。 本研究中，标准品的下限分别是：λ 噬菌体基因组 DNA100 拷贝，λ 基因组 DNA75 拷贝。其他的研究中得到过保 持线性关系的更低的下限浓度。对于一些需要检测到几个拷贝模板量的实验，例如分析很少的细胞数量或者痕量 DNA 样品，较高的灵敏度无疑有着重要的意义。 2．本方法适用于很多应用实例 本文的实验方法可以参考用于很多实验，当然也需要根据具体的要求和条件进行修改。因为 SYBR Green I 可以使 双链 DNA 更稳定，为了确保解链完全，可以将变性温度提高 2℃。此外，最好利用温度梯度摸索最佳退火温度，可以 借助熔解曲线分析和凝胶电泳来评价目的扩增产物的特异性和产量。 3．DMSO 本文的实验方法可用于分析多种样品。 用β-actin的引物扩增人类基因组DNA在扩增的纯度和方便性方面都是一个 极好的例子。 而通过添加DMSO等方法优化反应条件可以帮助扩增难于扩增的模板。 DMSO(二甲亚枫)是一种助解链剂， 对于一些以二级结构较强的DNA为模板进行的扩增反应而言， DMSO能降低扩增产物的变性温度。 DMSO的浓度低于5 ％（v/v）时都能产生较好的效果。但在反应体系中添加DMSO时需格外小心，因为DMSO减弱双链DNA稳定性的作用 会使结合于双链DNA的SGⅠ减少，从而降低荧光信号。添加DMSO也会同时降低扩增产物和引物的Tm值。建议实验 中逐渐增加DMSO的量以摸索最适用量。 4．读板温度的选择可以增加特异性 熔解曲线可以用来分析产物，以消除引物二聚体等副反应产物的影响。为了消除引物二聚体对 C(t)值的影响，每 个循环中的读板温度被调高到了 78℃，这一温度高于引物二聚体的 Tm 值。在这一温度下双链的引物二聚体变性，释 放出结合的 SGⅠ，从而消除了引物二聚体产生的荧光信号。在这一温度下较长的 PCR 产物仍保持复性状态，其数量 直接反映于荧光强度。读板温度通常设为比特异产物 Tm 值低 3℃。通过分析熔解曲线数据可以确定产物和引物二聚 体的熔解温度。 这里讨论的结果表明 DyNAzymesII 聚合酶在使用 SYBR-GreenI 染料实时荧光定量 PCR 实验中具有很好的效果。 本文列出的方法对于 λ 噬菌体基因组 DNA 和人基因组 DNA， 都能在较宽的线性范围内得到精确、 可重复的定量结果。 在使用 SYBR-GreenI 进行实时定量反应的实验中，优化变性、退火温度，考虑使用 DMSO，选择合适的读板温度，是 优化实验结果的一些基本方法。 参考文献 1. 2. 3. 4. 5. Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. (2000) Journal of Mol Endocrinology 25,169-193. Gibson, U.E., Heid, C.A. and Williams, P.M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. (1996) Genome Research 6, 995-1001. Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. (1996) Nature Biotechnology 14, 303-8. Morrison, T.B., Weis, J.J. and Wittwer, C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. (1998) Biotechniques 24, 954-9. Cosa, G., Focsaneanu, K.S., McLean, J.R., McNamee, J.P., and Scaiano, J.C. Photophysical properties of fluorescent DNA-dyes bound to single- and double-stranded DNA in aqueous buffered solution. (2001) Photochem Photobiol 73, 585-599.13东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月基因表达MJ Research Incorporated Application Note Vol.2, No.4在 MJ Research OpticonTM 2 实时荧光系统上利用 TaqMan 探针通过多重反转录 定量 PCR（RT-qPCR）对基因表达进行分析 Richard Kurtz, Ph.D and David Batey, Ph.D MJ Research , Inc, South San Francisco, CA摘要：本研究通过反转录定量 PCR(RTCqPCR )对正常组织和乳腺癌组织的 ERBB2 基因表达差异进行了研究。实验用 特异性的 Taqman 探针分别标记目的基因和作为内标的看家基因进行多重 PCR 反应， MJ Research 公司 Opticon 在 2 实时荧光定量系统上对模板进行定量分析。结果表明 ERBB2 基因在乳腺癌组织样本中的表达是正常组织中的 5.5 倍。这一结果表明在 MJ Research OpticonTM 2 实时荧光系统上利用 TaqMan 探针通过多重反转录定量 PCR （RT-qPCR）对基因表达进行分析具有很高的灵敏性和很好的重复性。 介绍： 反转录定量 PCR(RT-qPCR)具有很高的灵敏性和非常好的动力学检测范围，为基因表达分析提供了一个基准。应 用这一技术可以通过荧光强度变化对 PCR 反应产物进行实时监测。传统的方法，如溴化乙锭染色或放射性核素掺入标 记后的光密度扫描等，测定的都是 PCR 的终产物，而实时荧光定量技术能够对起始摸板进行定量，与传统方法相比实 时荧光定量技术显出了极大的优势。 实时定量技术中常用的一种方法是 TaqMan 探针法。TaqMan 探针法的定量 PCR 反应体系中，包括了一对 PCR 引 物和一条探针。荧光标记的探针与扩增产物特异性地结合。探针的 5′端标记有报告荧光基团(Reporter, R)，3′端或靠近 3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)， 当探针完整的时候， 报告基团所发射的荧光能量通过荧光共振能量传递 （FRET） 被邻近的淬灭基团所吸收,不能发出荧光信号。随着扩增反应的进行，具有 5′外切核酸酶活性的 Taq 酶在链延伸过程中 遇到与模板结合的探针，会从 5′端将探针水解为单核苷酸，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光 信号。所以，每经过一个 PCR 循环，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步指数增长的过程。 多重定量 PCR(Multiplex qPCR)技术能够在一个反应管中同时对多个模板进行定量， 被广泛应用于医疗机构和研究 单位。多重定量 PCR 技术通常用不同荧光基团标记多个目标基因特异的 Taqman 探针，借此实现用不同的荧光信号同 时检测不同目标基因的扩增过程。 多重反转录定量 PCR 技术的一个重要的应用就是同时在一个反应管中同时扩增目标 基因和看家基因，看家基因作为内标对目标基因的定量结果进行校正，以消除反转录过程以及样品制备过程产生的人 为差异对定量结果的影响。 在本研究中，利用多重定量反转录 PCR 对正常组织和乳腺癌组织的 ERBB2 基因表达差异进行了研究。已有研究 表明，在将近２５％的癌细胞样本中 ERBB2 基因过表达（正常细胞表达水平的３.2-135 倍） ，较差的愈后和较差的药 物疗效与 ERBB2 基因过表达有关。本实验用 FAM 标记的 TaqMan 探针对 ERBB2 基因表达进行定量，用 VIC 标记 的 TaqMan 探针对看家基因 GAPDH 的表达进行定量，通过看家基因 GAPDH 表达水平的定量结果对 ERBB2 基因表 达水平的定量结果进行校正。 材料与方法： 反转录定量 PCR 成人乳腺组织的总 RNA 从 Stratagene(735044)公司购得； 乳腺癌组织总 RNA 从 Ambion(7222)和 Invitrogen(64015-1)14东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月公司购得； 反应组分加到白色 PCR 微孔加样板中 （MJ Research, HSP-9601） 用透明光盖密封 ， （MJ Research, TCS-0803） . ２０的基因特异引物和探针混合物由 Applied Biosystems 公司以 Pre-developed TaqMan Assay Reagents(PDAR)形式提 供，GAPDH 特异的探针用 VIC 标记，ERBB2 特异的探针用 FAM 标记。QuantiTect Probe RT-PCR 酶和缓冲液系统从 Qiagen 公司（204443）购得。 在每一 RT-qPCR 反应管中分别加２ng 不同组织 RNA 作为模板。每一反应的反应组分如表１所示：空白对照中不加反转录酶，以监测非特异扩增的荧光信号。RT-qPCR 扩增程序如表 2 所示：同时设置一组定量标准样品,通过比较目标基因 C(t)与标准样品 C(t)对未知浓度目标基因进行定量。C(t)值是某一 特定扩增反应中荧光信号到达高于背景的某一设定的荧光值时所对应的循环次数。在本实验中，应用 Opticon Monitor 软件中的信噪比控制选项，将 C(t)值线（阈值高度）定义为第 3-8 个循环之间荧光信号强度平均值的 10 倍。这一阈值 被自动应用于给定实验的所有被检测样品孔。 对转录产物进行定量 将标准样品模板浓度对数值对其 C(t)值作图得到定量标准曲线。分别用含有 GAPDH 编码序列的质粒和 ERBB2 cDNA 的质粒的系列浓度梯度稀释样品作为定量标准样品生成各自的定量标准曲线。将乳腺组织 cDNA 中 ERBB2 cDNA 的特异 PCR 扩增产物连接到 pCR,2.1-TOPO(用 Invitrogen 公司的 TOPO Cloning Kit，按厂家产品说明操作)得到 含有 ERBB2 cDNA 的质粒。 组织样品中目标核酸定量计算通过 Opticon Monitor 软件完成。用每一组织样品目标基因 C(t)对照定量标准曲线来 对未知浓度目标基因进行定量。起始总 RNA 量（2ng）用作转录子拷贝数的参照。 结果的校正 为了比较正常组织和乳腺癌组织目的基因转录子的差异，用每 ng 总 RNA 中目标基因的拷贝数比上每 ng 总 RNA15东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月中 GAPDH 的拷贝数（目标基因拷贝/GAPDH 拷贝数）对每个样品中目标基因的拷贝数进行校正。每一组组织样品中 ERBB2 的表达量取平均数，确定目标基因在不同组织中表达量的比值。 结果： 通过多重 RT-qPCR 对转录子进行定量 如表 3 所示，无论正常组织样本还是乳腺癌组织样本，ERBB2 不同的定量重复实验中 C(t)值的标准偏差均小于或 等于 0.32 个循环，这一结果表明定量非常精确。无论是单一 PCR 反应还是多重 PCR 反应，每一组织样本 ERBB2 扩 增所得的平均 C(t)值相同。16东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月ERBB2 在正常组织和乳腺癌组织中的表达存在差异 Figure 1A 是根据含有 GAPDH 编码序列的系列浓度梯度稀释的质粒标准样品所检测出的荧光强度对 C(t)值作图得 到的标准曲线。Figure1B 是根据含有 ERBB2 cDNA 的系列浓度梯度稀释的质粒标准样品所检测出的荧光强度对 C(t) 值作图得到的标准曲线。浓度稀释范围都是从 106 拷贝至 10 拷贝，该范围在 Opticon 2 系统能够检测的动力学范围之 内。两种扩增反应中模板量的对数值对 C(t)值作图得到的标准曲线也分别列在 Figure 1A 和 Figure1B 中。所得标准曲 线回归系数均大于 0.99,显示出极好的线性关系。 假定反转录效率相同， 可以确定每种目的基因的转录子相对于总 RNA 的相对量。 实验中用每 ng 总 RNA 中 GAPDH 的拷贝数来对每 ng 总 RNA 中目标基因的拷贝数进行校正。结果如 Figure2 所示，经校正以后，ERBB2 在两份乳腺癌 组织样品中的表达量分别是正常组织样品中表达量的 1.6 和 5.5 倍。讨论; 在 Opticon 2 系统上进行的 RT-qPCR 能够检测微小的基因表达差异 在本研究中， 采用以 Taqman 探针为标记的多重 RT-qPCR 同时对目标基因和看家基因的转录子拷贝数进行了定量 分析。结果显示 ERBB2 在乳腺癌组织中的表达是正常组织中表达量的 1.6-5.5 倍。这一结果与前人报道的在癌细胞中 ERBB2 表达量会上升相一致。 关于多重 PCR 多重 PCR 要求能够区分不同扩增反应相应的荧光信号，Opticon 2 在这方面表现出卓越的性能。多重 PCR 能够同 时检测目标基因和看家基因，通过看家基因做为对照对不同样品间反转录效率差异和 PCR 扩增差异进行校正。 在这一研究中，同一组织样品中同一目标基因的 C(t)值在单一 PCR 中与在多重 PCR 中无明显差异，所以在一个 反应中进行多种模板的扩增，不同的目的基因扩增相互之间并未有明显的影响。对于一个成功的多重 PCR 而言，每一 种目标基因扩增都必须有相近的效率。否则，在多重反应条件下任何一点微小的差异都会被放大。因此，条件优化非 常重要，通过条件优化使得每一个反应都有相同的扩增效率并筛除那些在同一管中相互之间起反应的引物。这一方法 可以对非常广的起始模板范围进行准确的定量。 单管 RT-qPCR 在一个反应管中目的基因特异的引物被同时用于反转录和定量 PCR 步骤中。这一设计减少了样本处理过程，并增 加检验特异性。另一种方案是用六核苷酸的随机引物或者 oligo(dT)作为反转录引物，反转录产生稳定的 cDNA 库。用 这一 cDNA 库作为模板，通过不同的反应对某些特异基因进行定量分析。这一方法对初始样本量有限的大量目标基因 定量分析非常有利。17东胜创新技术通讯用标准曲线进行定量Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月对于一些分析而言，如细胞繁殖状态的改变，只要知道基因表达的相对变化就足够了。在这种情况下，特异基因 表达量和持家基因表达量的比值可以用 C(t)值的比例关系衡量。这一比值的差异可用于样本表达差异的评估。通过 DNA 标准样作出的标准曲线计算出的转录样本的量值仅是相对值， 但这样得到的转录子相对拷贝数对于比较基因表达 差异已经足够。然而这一方式的灵敏度是建立在假定 RNA 分离和 cDNA 合成效率相同的基础上。如果要绝对定量， 需要有 mRNA 标准样品反转录成 cDNA 作为 PCR 标准模板。 实时定量 PCR 所需试剂 选择合适的实时定量 PCR 相关试剂需要进行多方面的考虑，包括特异性，成本及整体实验设计方案。用 DNA 双 链特异结合的荧光染料例如 SYBR GREEN I(SGⅠ)时仅需要一对扩增引物。用 SGⅠ实验设计简单，成本低廉，可用于 多种目标基因的检测。然而 SGⅠ能够非特异的结合于所有双链 DNA，会导致较高的荧光背景和低特异性。 TaqMan 探针与目标基因扩增产物特异性杂交保证了扩增过程中荧光的特异性。当探针未结合时，其结构完整， 报告基团被激发时产生的荧光能量通过荧光共振能量传递（FRET）被邻近的淬灭基团所吸收,不能发出荧光信号。 Taqman 探针的高信噪比非常有利于定量低浓度的核酸。除此之外，可以对 Taqman 探针标记不同的荧光基团，这样可 以进行多重 PCR。RT-qPCR 可以高通量的对转录拷贝数进行定量，具有很好的重复性。如果用传统的基因表达定量方 法例如 Northern 杂交进行分析，非常困难，缺乏灵敏性并耗时费力。本文所用的研究方法可被广泛应用于基因表达研 究，例如组织之间的基因表达差异，监测外界环境刺激对基因表达的影响。除此之外，利用 Opticon 2 系统的多色多通 道功能，我们能够用不同的荧光探针进行多重扩增反应，在同一个样本中同时分析多个目标基因，这在成本和通量上 都具有很大的优势。 参考文献 1. 2. 3. 4. 5. Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. (2000) Journal of Molecular Endocrinology 25, 169-193. Gibson, U.E., Heid, C.A. and Williams, P.M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. (1996) Genome Research 6, 995-1001. Holland, P.M. et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’→3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. (1991) Proc Natl Acad Sci 8, . Lennon, G., Auffray, C., Polymeropoulos, M. and Soares, M.B. The I.M.A.G.E. Consortium: an integrated molecular analysis of genomes and their expression. (1996) Genomics 33, 151-152. Bieche, I., Onody, P., Laurendeau, I., Olivi, M., Vidaud, D., Lidereau, R. and Vidaud, M. Real-time Reverse Transcription-PCR Assay for Future Management of ERBB2-based Clinical Applications. (1999) Clinical Chemistry 45(8), . 6. 7. 8. 9. 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Mickey Williams Genentech Inc., One DNA Way, South San Francisco, California 94080摘要 本文对采用实时反转录定量PCR方法（RT-PCR）定量分析心肌肥大体外模型中尿钠素和c-fos基因表达水平进行了验证。这种方法样品用量少，无需反应后处理。在实时反转录定量PCR中，双标记的荧光探针伴随扩增反应的进行 逐渐降解。 荧光报告基团发出的荧光到达阈值线的时间 （用PCR循环数来衡量） 与加入的目标mRNA量相关。 使用oligo (dt) 磁珠法增加了从96孔板中的培养细胞提取mRNA的产量，并减少了DNA的污染。结果显示在不同的方法处理的细 胞间，利用GAPDH基因对RNA的载量进行均一化无差异。我们讨论了两种计算倍数增加的方法：标准曲线法和??Ct 法。实时定量RT - PCR被用来确定c C fos诱导的时间进程以及4 种不同剂量的已知肥大因子对培养的心肌细胞中心钠 素mRNA表达水平影响。我们结果与已发表的Northern分析结果相符。 以前曾讨论过实时PCR和RTCPCR这些新的技术(1-3)。简单的说，实时PCR和RTCPCR实时监测扩增反应中的双标记 荧光探针(Taq-Man探针)的降解。Taq聚合酶5’外切酶活性能切除探针，特别是将5‘的报告荧光基团与3’的淬灭荧光基 团分开，导致报告荧光基团发出的荧光增强。这些数据表现在扩增曲线上。Ct值就是以报道基因发出的荧光超过阈值 线（与系统的背景荧光相关）的时间（用PCR的循环数测量）来计算的。如先前所述，Ct值与加入的目的mRNA的水 平有关，当加入的目的mRNA的水平高时，报告荧光基团发出的荧光到达阈值线所需要的PCR循环数就越少，其Ct值 就低（1，2）。 本文中，我们验证了用实时RT-PCR方法分析一个已研究过的初级培养细胞系统中的基因表达。几年前，一种新的 培养细胞中的心肌肥大反应与体内的心肌肥大反应有些共同的 大鼠的心肌细胞培养系被用作心肌增大的体外模型（4）。 特点，如每个细胞中蛋白和RNA含量增多、收缩蛋白单体增多并组装为肌节单元、包括c-fos基因的明显的早期基因程 序的激活，以及胚性基因如编码尿钠素(ANF)2基因的转录激活(5)。本文中使用定量RT-PCR研究两种基因ANF和c-fos 在用苯肾上腺素(PE)、 白血病抑制子(LIF)、 内皮素(ET)、 和前列腺素F2-a (PGF2a)等四种不同的肥大因子刺激后的反应。 材料和方法细胞培养用一系列胶原酶消化，并用Percoll梯度离心机纯化，从一天的SpragueCDawley大鼠中分离到大鼠初生心肌细胞。 如前所述，细胞在用4%胎牛血清预包埋的96孔板中培养(6)。将细胞置于无血清的F12/DME中并加入10?g/ml 的铁传递 蛋白, 1?g /ml 的胰岛素, 1?g /ml 抑肽酶, 2 mM 谷氨酸, 100 U/ml 青霉素G和100 mg/mL链霉素，培养密度为每孔 1.5x104个细胞。细胞在37°C 时孵育18小时并加入肥大因子。这些因子在剂量响应实验中添加了48小时，在时间进程 实验中，在不同的时间添加。 mRNA 的制备 使用Promega PolyATtract Series 9600 mRNA抽提试剂盒提取Poly(A)+ mRNA。该试剂盒包括高性能的链霉亲和素 磁粒，联有生物素的oligo(dt)和一个96针的磁铁，来从96孔板中生长的细胞里纯化出mRNA。细胞培养液被吸去，加入 GTC抽提缓冲液，使细胞分散均匀。每一种处理做四个重复。每孔中分出的RNA被分成两份，一份用于分析目的基因， 另一份被用来分析GAPDH。总RNA的制备使用Qiagen RNeasy midi-columns提取总RNA. 按照说明操作。19东胜创新技术通讯RTCPCR反应和条件Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月从25 ?L的各种mRNA中取10?L加入总体积50 ?L的反应液中。反应液包含0.5 ?M的各种寡核苷酸引物, 0.2 mM的 dNTP(each), 100 nM 荧光标记的寡核苷酸探针, 1xRTCPCR buffer, 2.5 mM MgCl2, 0.1 U/?L TF1 DNA聚合酶和0.1 U/?L AMV反转录酶(Promega Access RTCPCR System). 48°C保持45分钟进行反转录，然后进行PCR 。程序如下： 94°C，30s 60°C，1min 69°C，2min 共40个循环。引物和探针的设计如表1所示设计引物和探针。反应的优化用从培养的新生肌细胞中提取的poly(A) mRNA对大鼠的ANF和c-fos引物和探针混合物进行了测试, 来确定它们 在实时荧光定量PCR仪上进行RTCPCR反应时产生信号的效果。ANF和c-fos引物与探针产生了较好的扩增曲线。调节 镁离子浓度以优化反应条件。选择能产生最高信号强度且无非特异性扩增的最大镁离子浓度。 结果样品制备的检测RTCPCR检测中的一个重要步骤是确定检测到的信号来自RNA 的RTCPCR扩增，而不是来自污染的DNA。本实验 用oligo(dt)磁珠法富集96孔板中的poly(A) mRNA。为了检测RNA制备过程中的DNA污染，分析了GAPDH。GAPDH 常 被选做看家基因，如同其他的看家基因一样，GAPDH在真核生物基因组中存在多个拷贝。因此，其序列将代表基因组 中多个靶点，提供了一种检测DNA污染的灵敏的方法。由于许多拷贝是缺少内含子的假基因，假基因的存在使得难以 用选择引物的方法区分RNA和DNA的扩增产物。图1展示了PCR和RT-PCR中三个不同孔。如图所示RTCPCR中GAPDH Ct 值的平均值是17.5个循环，而在PCR中GAPDH Ct 值的平均值为29.4个循环。来自污染的DNA的GAPDH Ct值明显 在RNA分析的范围之外， 因而不会干扰RNA分析这些数据也证明这种分离方法从96孔各板上的得到的RNA产物产量重 复性好。此外，用这种方法对ANF和c-fos序列进行分析，未检测到假的反转录信号。这证明了本法纯化的RNA对于本 次定量实验纯度足够。20东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月Figure 1看家基因的确认另一个重要的验证方面是保证用于对RNA上样量做均一化的基因确实在本实验的处理过程中是不变的。GAPDH 被选做本检测的看家基因主要是参考以前心肌增生基因表达的研究(7C10)。本实验中使用GAPDH做看家基因的重要性在 以下几方面。首先， poly(A) RNA的量不足以用通常的定量方法对。其次，使用看家基因是确定样品量一致的唯一方 法。此外，被选做均一化处理的看家基因通常表达量较高，在旧的定量方法（如Northern和RNase保护）中较易饱和， 不能准确的对靶基因定量。表2显示了不同样品中GAPDH的定量结果，包括对照组与PGF2a处理组。表中列出了不同 的细胞孔的数据，细胞密度相同，培养48小时。有三个孔细胞未被处理，做对照；有三个孔用10-6 M PGF2a 处理48小 时的细胞。差别反应在细胞接种、各孔RNA 得率、生物状态的变化(如PGF2a 响应的生物差异性)、实时定量结果的 差异。 我们曾报道实时定量PCR方法是精确的（如加入的靶序列动力学范围为6时，标准偏差小于0.5（1））。对照Ct 平均值为17.92，其标准误差平均为0.18。PGF2a 处理的GAPDH的Ct 平均值为16.57，其标准误差平均为0.03。标准偏 差很小，这再一次说明了这种方法的精确性。然而有一种明显的趋势，PGF2a 处理的GAPDH的Ct 轻微减少。这一结 果暗示两种可能，PGF2a处理的孔或者有更多的细胞，或者每个细胞GAPDH mRNA的表达量有所增加。先前的报道暗 示，后一种解释或许是对的。使用这一细胞系统的实验已表明诱导细胞肥大的因子增加了细胞的表面和细胞蛋白质含 量(11)，但并不增加细胞数量。此外有报道，伴随着细胞肥大反应，细胞的RNA水平也会增高。为了在我们的系统中验 证这种组织，在6个100-mm板上接种了相等数目的肌细胞。三板细胞用PGF2a处理，三板做对照。细胞用胰蛋白酶消 化48小时。每孔中分出部分细胞来确定每板细胞数，余下的细胞用来制备总RNA，表3表明对照和PGF2a处理的细胞平 均数非常相似。对照中平均每板得到的总RNA为16.08?g，PGF2a处理的平均每板得到的总RNA为30.92?g。在PGF2a 处理的细胞中，平均每个细胞的总RNA大约增加了两倍。这与比较GAPDH mRNA的表达水平得到的结果符合，即与 对照组相比， PGF2a处理增加了GAPDH mRNA的表达水平。 对照细胞中15 ng总RNA的Ct平均值为16.28个循环， PGF2a 处理细胞中15 ng总RNA的平均Ct值为16.55个循环。这一结果支持使用GAPDH mRNA的表达水平来对每一次实验中 mRNA的加入量进行均一化处理。值得注意的是每个细胞中GAPDH的表达水平也增高了。21东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月定量的方法在解释基因表达数据的时候一定要考虑定量的方法，每种方法都要求一种假设，重要的是要记住这种假设，并清 楚改假设会给实验结果带来何种影响。以前的工作展示了实时PCR的线性并详细的阐述了用标准曲线对靶基因相对定 量的方法（1）。简单说来，标准曲线方法使用标准RNA样品，标准曲线通过梯度稀释制备，用来对目的基因和看家基因 进行分析，结果数据被用来生成标准曲线和线性方程。看家基因的标准曲线由其Ct 值对RNA的量做图（Figure 2A）。 而目的基因的标准曲线由其Ct 值对任意的表达倍数做图。 要计算未知样品的相对表达量， 首先通过看家基因的标准曲22东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月线求出总RNA量。然后目的基因的Ct被用来计算相对的基因表达。最后，目的基因的表达量由看家基因决定的总RNA 量来做均一化处理。 另一种是用??Ct方法进行相对定量。??Ct方法使用单一的样品（被称为校正样品）来比较未知样品的目标基因的 表达。校正样品在每个板上与未知样品同时分析。校正公式为： 这里??Ct= [Ct GI(未知样品)-Ct GAPDH(未知样品)]- [Ct GI (校正样品) - CtGAPDH (校正样品)]。GI是目的基因， 校正样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品（如未处理的肌细胞）。 这一公式基于这样一种假设：目的基因的扩增效率与看家基因的扩增效率相同，并且目标基因扩增一倍其Ct值减 少一个循环。很少会与这一假设完全相符，然而，这种方法的优越性在于，由于无需在每个板上对靶基因进行标准曲 线分析使样品的通量得以增加，并且这一方法更有益于检测基因表达的诱导或下调。 ??Ct和标准曲线的比较列在Fig. 2中。所用细胞为0.1 nM ET-1处理的细胞或未处理的细胞。制备Poly(A) mRNA ， 使用实时RTCPCR 对Poly(A) mRNA进行分析。正如所示，尽管这个例子并不完全符合??Ct方法的假设，但所有的方 法都给出了相似的结果。通过??Ct方法得到的ET-1处理后ANF 表达增加的倍数为4.5倍，而使用标准曲线法得到的结 果为增加3.0倍（Fig. 2C ）。通过对每个重复样本的分析表明每种方法都产生了可重复的结果(Fig. 2B)。再次值得一提 的是， 重复样本代表的是不同的细胞孔， 变化包括了生物差异性、 RNA得率和实时RTCPCR的差异。 标准曲线法和??Ct 法都依靠与在每一个后续实验中都再次运行的校正样品的进行比较。.增加每一个样品的重复样本将增加数据的精确 性，但如果不符合??Ct方法的假设就不会提高定量的精确性。四种不同的肥大因子在培养的肌细胞中对c-fos和ANF诱导的影响23东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月一些能引起心肌细胞肥大的因子的系列剂量被添加到培养细胞中。已有研究表明PGF2a、LIF、PE和ET以一种剂 量依赖的方式诱导细胞肥大(11C13)。Poly(A) RNA源于处理48小时后的96孔板。看家基因GAPDH被用来校正来自每个孔 的RNA得率。 Figures 3aC3d显示了不同处理方式对ANF mRNA的相对诱导倍数(??Ct分析)。 ANF mRNA 诱导所需要的每种因 子的剂量与产生形态学反应所要求的剂量相关性很好(6,11)。接着，用最大剂量的四种因子处理后在多次时间对c-fosmRNA的水平进行检测。正如所期待的立即的早期基因响应，时间进程非常短。在所有的例子中，c-fos mRNA的表达 水平在处理四小时后回到了基线水平。所有的因子在处理30分钟后产生了最大的c-fos诱导。PGF2a 对ANF mRNA 产 生了最大的诱导，而PE 对c-fos 产生了最大诱导。 讨论 在这篇报道中，我们使用实时RTCPCR来检测心肌肥大体外模型中c-fos和ANF基因的表达水平。本文阐明了使用 实时方法对基因表达进行定量的优点：对任何给定的生物学处理方法都能进行多重反应；检测灵敏，只需要很少的样 品；不要求处扩增后的处理；这样节省了时间并减少了实验室PCR产物污染的风险。 我们的RNA处理方法导致最少的基因组DNA污染和培养孔重复样本的RNA产率的可重复性。 我们也展示了看家基 因验证相对简单，并确保可以使用这样一个基因进行RNA 量的均一化处理。 我们用来进行基因表达测量的两种方法都有某些优点。 ??Ct方法比标准曲线方法有更高的通量。 但??Ct方法要求 几个假设（如：100%的扩增效率，互相比较的每种基因标准曲线斜率相同）。标准曲线方法不要求这些假设，但要求 分析更多的标准样品。我们相信两种方法对于基因表达的比较都是有效的，并会产生可重复的结果，虽然如果假设并 未满足，??Ct方法的定量准确性将降低。如同所有的分析方法一样，增加样品的重复样本将增加数据的置信度。结果 表明用本文的方法检测的基因表达水平的差异与其他生物学方法（如ANF mRNA诱导发生的剂量与引起肌细胞尺寸增 大的剂量相同）测量的基因表达水平的差异相吻合。此外，对两个基因的分析表明不同的因子结果的不同，PGF2a 增 加ANF mRNA的水平， 而PE增加c-fos mRNA的水平。 这些基因的表达结果与已发表的Northern分析的结果吻和14, 15) (8, 10C12,。 总之，表明使用96孔板体外培养系统，结合96孔RNA纯化方法和实时RTCPCR方法是分析基因表达改变的一种有效方法。这三种方法的结合使用比其他的方法有明显的好处。实验可以在培养容器中进行，并直接进行RNA提取并在 96孔板中进行实时RTCPCR 。 参考文献 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 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Invest. 96, .25东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月基因芯片分析结果复证使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术采用通过监测产物积累进行的实时反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）可以用来验证基因表达的差异。我们在此 报道了一种基于SYBR Green I染料进行的实时PCR定量方法并通过产物的融解曲线来确定在基因表达谱方法中确定的 基因表达差异的重复性。因为SYBR Green I染料是一种非特异性的结合染料，所以反应使用了“热启动”PCR以及通 过经验性数据来确定退火以及检测产物的温度。相对的基因表达水平可以通过使用一系列的cDNA浓度做出标准曲线 来进行定量。使用这种方法，实时PCR可以确定DNA阵列71%（17／21）的准确性，和91%（1／31）的差异显示的准 确性。 验证DNA阵列的基因表达差异与杂交信号的强弱有关。 实时RT－PCR结果表明DNA表达差异在2－4倍间的差异 无法判断其正确错误与否。而差异显示PCR的结果验证不依赖于信号的强度。无论是何种基因表达谱技术（微阵列， DDPCR，基因表达系列分析技术还是差异杂交技术），如果已经知道目的基因的序列，那么实时RT－PCR方法就可以 适用于验证这些差异表达，因为它具有定量功能而且需要的RNA量比传统方法要低1000倍。 DNA阵列（微阵列）和差异RT－PCR方法是两种可靠的确证基因表达和基因组广泛转录本差异的方法。这些技术 确定样本表达差异的重复性和敏感性的可靠性受到几个因素的影响。微阵列的实验结果受到阵列产物、RNA提取、探 针标记、杂交温度条件和图像分析（1－4）的影响。DD－PCR结果受到电泳分辨率、弱和差异引物、条带确证和结合 部分的影响。因为这些可靠性上的限制，被确定为差异表达的基因要经过另一种方法的检测。Northern杂交或者RNA 酶保护分析都是有效的但是至少要5mg的RNA。传统的逆转录聚合酶链式反应（RT－DDPCR）要求的RNA要少一些， 但其终点分析缺乏定量上的精确性（6－8）。实时RT－PCR技术方法是当前最新的确定基因表达的方法，在这篇报道 中，我们详细描述了使用实时PCR技术和其与DNA阵列以及DD－PCR技术的相互结合，来验证基因表达的正确性。 方法描述: 基本策略 为了满足验证表达谱研究确定的大量基因，我们研究了实时定量PCR系统并使用SYBR Green I染料。此外，还用 每个基因的一系列已知浓度的模板制作了绝对定量曲线，以相对比较不同的样本。相对定量曲线只需要使用在表达谱 研究中确定的一个高表达样本中获得的cDNA的一系列稀释度制作完成。 尽管仍然需要设计基因特异性的引物，但不需要设计内在的基因特异性的荧光探针。此外，反应的特异性由产物 的Tm值确定（Tm：DNA双螺旋一半解链时的温度）。反应的特异性由“热启动”PCR得到提高，并在低于产物Tm值 1－2℃时获得信息。这样就可以避免由通常来说Tm值较低的引物二聚体引起的非特异性信号（10）。 实时PCR的反应条件逆转录反应条件使用在基因表达谱分析中采用的总RNA进行验证实验。采用SuperScript First Strand Synthesis System进行RT-PCR （Invitrogen, Carlsbad, CA)） 反应来合成cDNA， 反应体系为20ul， 里面包含1 mgDNaseI处理过的总RNA， mM TrisCHCl 20 (pH 8.4)，50mMKCl，2.5mMMgCl2，10mMdithiothreitol (DTT)，0.5 mg oligo(dT)12C18, dNTP（各0.5mM dATP, dGTP, dCTP,和dTTP）以及200 U SuperScript II Reverse Transcriptase。混合组分时，先混合RNA和oligo(dT)，70℃保温10分钟， 再放到冰上并加入剩余的反应组分。 反应在42℃孵育1小时， 然后再70℃加热15分钟终止反应。 cDNA再加入2 U的RNase H (Invitrogen) 37℃孵育20分钟，再在70℃加热15分钟终止反应。此外用一个没有逆转录酶的反应来验证是否有基因组 DNA的污染（无RT对照）。cDNA在使用前放置在－20℃保存。进行实时定量PCR前不需要进行cDNA的纯化。26东胜创新技术通讯Eastwin Technical Notes ───────── 实时荧光定量 PCR 专辑2004 年 4 月确定实时定量PCR的反应条件使用GENSET OLIGOS, Oligo Version 4, (GENSET Corp., La Jolla, CA)或者LASERGENE的PRIMERSELECT软件 (DNASTAR, Inc., Madison, WI)计算产物的Tm值来确定反应的退火温度。摸索退火温度时，每次以计算得到的Tm值增 加或减少2－3℃，直到其与引物二聚体和非特异性产物间有3－5℃的