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生物化学课件-第1章-蛋白质的结构与功能.ppt
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文档介绍：疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第四节蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein（二）?-螺旋结构要点:①多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。②每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。③每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。（三）?-折叠①多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。②两段以上的β-折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行。③两链间的肽键之间形成氢键，以稳固β-折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。（四）?-转角和无规卷曲?-转角：无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。①肽链内形成180o回折。②含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。③第二个氨基酸残基常为Pro。?-转角：（五）模体蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体(motif)。螺旋－环－螺旋锌指（六）影响二级结构形成的因素氨基酸侧链所带电荷、大小及形状。影响α-螺旋形成的因素：β-折叠形成条件：　　要求氨基酸侧链较小。三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。稳定因素：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。定义肌红蛋白(Mb)N端C端纤连蛋白分子的结构域结构域(domain)大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状请选择栏目：
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蛋白质结构与功能之间的关系
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蛋白质的结构与功能的关系
1.蛋白质一级结构与功能的关系
（1）一级结构是空间构象的基础 蛋白质一级结构是空间构象的基础，也是功能的基础。
（2）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能 ?
（3）氨基酸序列提供重要的生物进化信息 ?
（4）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病 ?
若一级结构发生改变影响其功能，称分子病。如血红蛋白&亚基的第6位氨基酸由谷氨酸转变成缬氨酸后，可导致镰刀形贫血。但并非一级结构的每个氨基酸都很重要。?
2.蛋白质高级结构与功能的关系
蛋白质空间构象与功能有密切关系。生物体内蛋白质的合成、加工和成熟是一个复杂的过程，其中多肽链的正确折叠对其正确构象的形成和功能的发挥至关重要。若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病的发生，称为蛋白质构象疾病医学教育|网搜集整理。?
成年人红细胞中的血红蛋白主要由两条&肽链和两条&肽链组成（&2&2），&链含141个氨基酸残基，&链含146个氨基酸残基。胎儿期主要为&2&2，胚胎期主要为&2&2.血红蛋白的4条肽链组成4个亚基，各亚基构象变化可影响亚基与氧的结合。?
疯牛病是由朊病毒蛋白（PrP）引起的一组人和动物神经的退行性病变，具有传染性、遗传性或散在发病的特点。其致病的生化机制是生物体内正常&?螺旋形式的PrPC转变成了异常的&-折叠形式的PrPSc.
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蛋白质的结构和功能
09:50& 双博士丛书
　　　　蛋白质的结构与功能考点：
　　组成蛋白质的20种氨基酸的类别、分类依据及几种特殊氨基酸的分类；
　　氨基酸的理化性质、成肽反应及体内重要的生物活性肽；
　　蛋白质的分类及分子结构；
　　蛋白质的结构(包括一级结构与空间结构)与功能的关系；
　　蛋白质的理化性质、分离纯化的基本方法及其原理；
　　蛋白质一级结构的测定(即多肽链中氨基酸序列分析)和空间结构的测定。
　　重点：
　　氨基酸的分类及理化性质，蛋白质的一级和空间结构及其与功能的关系，分离纯化蛋白质的原理和方法。
　　难点：
　　蛋白质一级结构的测定，这也是众多研究者花费多年才解决的难题，我们只需弄清楚其要步
　　骤及各步的基本原理和方法即可。
　　基本知识与理论：
　　一、蛋白质的生物学功能(了解即可)
　　蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命，生物体结构越复杂，其蛋白质种类和功能越繁多，
　　其主要的生物学功能是：
　　（一）催化和调节能力
　　某些蛋白质是酶，催化生物体内的物质代谢反应。
　　某些蛋白质是激素，具有一定的调节功能，如胰岛素调节糖代谢、体内信号转导也常通过某些蛋白质介导。
　　（二）转运功能
　　某些蛋白具有运载功能，如血红蛋白是转运氧气和二氧化碳的工具，血清白蛋白可以运输自由脂肪酸及胆
　　红素等。
　　(三）收缩或运动功能
　　某些蛋白质赋予细胞与器官收缩的能力，可以使其改变形状或运动。如骨骼肌收缩靠肌动蛋白和肌球蛋
　　（四)防御功能 如免疫球蛋白，可抵抗外来的有害物质，保护机体。
　　（五）营养和储存功能如铁蛋白可以储存铁。
　　(六）结构蛋白
　　许多蛋白质起支持作用，给生物结构以强度及保护，如韧带含弹性蛋白，具有双向抗拉强度。
　　（七）其他功能
　　如病毒和噬菌体是核蛋白，病毒可以致病。
　　二、蛋白质的分子组成
　　（一）元素组成
　　组成蛋白质分子的主要元素有碳、氢、氧、氮、硫。有些还含有少量磷或金属元素。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％，且蛋白质是体内的主要含氮物，因此可以根据生物样品的含氮量推算出蛋白质的大致含量。
　　（二）氨基酸
　　氨基酸是蛋白质的基本组成单位，存在于自然界的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-α-氨基酸（甘氨酸除外）即左旋氨基酸，因为甘氨酸无手性碳原子(与四个不同的原子或基团相连的碳原子)，大多数有手性碳原子的是手性分子，手性分子有旋光活性。根据它们的侧链R的结构和性质可分为四类：
　　1．非极性疏水性氨基酸：
　　这类氨基酸的特征是在水中的溶解度小于极性氨基酸。
　　2极性中性氨基酸：
　　这类氨基酸的特征是比非极性氨基酸易溶于水，且羧基数等于氨基数，故为中性氨基酸，但因为羧基电离能力较大，故其实际上具有弱酸性。
　　3．酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸。这两种氨基酸都含有两个羧基，在生理条件下带负电，故为酸性氨基酸。
　　4．碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。这类氨基酸在生理条件下带正电，故为碱性氨基酸。
　　还需要记住这20种氨基酸的英文缩写符号，尤其是三字符号，并且这四种类别的氨基酸中还有几种特殊的氨基酸，也需记住它们的独特特征。
　&&&&&芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分子中含有芳香环
&&&&&&&含硫氨基酸：甲硫氨酸、半胱氨酸分子中含硫元素，甲硫氨酸也叫蛋氨酸。
&&&& & 亚氨基酸：脯氨酸，其氨基处于环中，为亚氨基酸
&&&&&& 支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，这三种均含有支链
&&& 　其中有八种氨基酸人体内不能自身合成，必须从食物中获得，称为必需氨基酸，它们是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
　　三、氨基酸的理化性质
　　（一）两性电离及等电点
　　氨基酸分子中含有碱性的α-氨基和酸性的α-羧基，能与酸或碱类物质结合成盐，故它是一种两性电解质。在某一pH值的溶液中氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势与程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点(pI)。这里有一个等电点的计算问题：
　　1侧链R为非极性基团或虽为极性但不解离的，此种氨基酸的等电点主要由α-氨基和α-羧基的解离常数的负对数pK1，pK2决定，pI=1/2(pK1+pK2)
　　2侧链基团可以解离，则由α-氨基，α-羧基及R基团解离情况共同决定，只需写出电离式，取其兼性离子两边的pK值的平均值即可。如赖氨酸其电离式为：
　　由电离式可以看出，其兼性离子两边pK值分别是pKα-NH3+和pKε-NH３+而与α-羧基无关故其pI=1/2 (8.95+10.537)=9.74
　　（二）紫外吸收性质
　　色氨酸、酪氨酸在280nm波长附近有最大的紫外吸收峰，由于大多数蛋白
　　质含有这类氨基酸，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸
　　收值，是分析溶液中蛋白质含量的快速简便方法。
　　（三）茚三酮反应：氨基酸+茚三酮水合物→还原茚三酮+氨，还原茚三酮+氨+茚三酮→蓝紫色化合物
　　此化合物最大吸收峰在570nm波长处，由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比，因此可以作为氨基酸定量分析的方法。
　　四、肽
　　(一)肽键
　　两分子氨基酸可由一分子所含的氨基与另一分子所带的羧基脱去一分子水缩合成二肽，两个氨基酸之间产生的酰胺键称为肽键，具有不典型双键性质。由10个以内的氨基酸缩合而成的肽称为寡肽，更多的氨基酸相连而构成多肽。pr是具有更大分子量的多肽链，但多肽和pr在分子量上很难划出明确界限，实际应用中只有一个习惯上的划分。肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全，称为氨基酸残基。多肽链中自由氨基末端称为N端，自由羧基末端称为C端，命名从N端指向C端。
　　（二）生物活性肽
　　1．谷胱甘肽
　　由谷氨酸和甘氨酸和半胱氨酸组成的三肽。第一个肽键比较特殊，由谷氨酸γ-羧基与半胱氨酸的氨基组成。分子中半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团。此巯基具有还原性，要记住谷胱甘肽的生理作用：①作为体内重要的还原剂；保护蛋白质或酶免遭氧化，使它们处在活性状态②可还原细胞内产生的H２Ｏ２，避免细胞受损③其巯基具有嗜核特性，能与外源的致癌剂或药物等结合，从而阻断它们与DNA、RNA或蛋白质结合，保护机体免遭损害。
　　2．多肽类激素及神经肽。 体内有许多激素属寡肽或多肽，如催产素、促肾上腺皮质激素，促甲状腺激素等。神经肽是在神经传导过程中起信号转导作用的肽类，如脑啡肽、β-内啡肽等。
　　五pr的分类
　　pr的分类分单纯pr、结合pr，后者除aa外，还含有非pr部分即辅基，绝大部分辅基以共价健与pr部分相连，根据形状分纤维pr及球状pr
　　六、蛋白质的分子结构
　　(要注意构成各级结构的化学键)
　　可分为一级、二级、三级、四级结构四个层次，后三者统称为高级结构或空间构象。蛋白质的空间构象涵盖了蛋白质分子中每一个原子在三维空间的相对位置，并非所有pr都有四级结构，由二条或二条以上多肽链形成的pr才有四级结构。
　　（一）蛋白质的一级结构
　　蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。主要化学键是肽键和二硫键。一级结构是蛋白质空间结构和特异生物学功能的基础。氨基酸排列顺序的差别意味着从多肽链骨架伸出的侧链R基团的性质和顺序对于每一种蛋白质是特异的――因为R基团大小不同，所带电荷数目不同，对水的亲和力不相同，所以蛋白质的空间构象也不同。
　　（二）蛋白质的二级结构
　　蛋白质的二级结构指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。维系二级结构的化学键主要是氢键。二级结构的主要形式包括：α-螺旋结构、β一折叠、β-转角和无规则卷曲。
　　1肽单元。
　　参与肽键的6个原子Cα1、C、O、N、H、Cα2位于同一平面，且Cα1、Cα2在平面上所处的位置为反式构型，此6个原子即构成了肽单元，其基本结构为
　　图中的A、B键是单键，可自由旋转，也正由于这两个单键的自由旋转角度，决定了相邻肽单
　　元之间的相对空间位置。其中的肽键有一定程度双键性质，不能自由旋转。
　　2．α-螺旋。
　　多肽链主链围绕中心轴有规律的螺旋式上升，每隔3．6个残基螺旋上升一圈，每个氨基酸残基向上平移0．15nm，故螺距为0．54nm。螺旋的走向为右手螺旋。α-螺旋的每个肽键的N－H和第四个肽键的羰基氧形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平行，侧链R基团则伸向螺旋外。
　　3．β-折叠。
　　多肽链充分伸展，每个肽单元以C为旋转点折叠成锯齿状结构，侧链R基团交错位于锯齿状结构的上下方。可由两条以上肽链或一条肽链内的若干肽段折叠成锯齿状结构。平行肽段间靠链间肽键羰基氧和亚氨基氢形成氢键，使构象稳定，此氢键方向与折叠的长轴垂直。两条平行肽链走向可相同或相反，由一条肽链折返形成的β-折叠多为反式，反式平行较顺式平行更为稳定。
　　4．β-转角和无规卷曲。β-转角常发生于肽链进行180度回折时的转角上，通常由4个氨基酸残基组成，其第一个残基的羰基氧与第四个残基的氨基氢可形成氢键。β-转角第二个残基常为脯氨酸，因为其N原子位于环中，形成肽键N原子上已没有H，不能再形成氢键，故走向转折β-转角常发生在蛋白质分子的表面，这与蛋白质的生物学功能有关。无规卷曲用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。
　　5．模序。指在许多蛋白质分子中，可发现两个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间结构，称为模序。实际上它是一种超二级结构。一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。常见的α-螺旋―环―α-螺旋结构及锌指结构，前者可结合Ca2+，后者可结合Zn2+，使α-螺旋能镶嵌于DNA的大沟中。
　　因此含此结构的pr可与DNA或RNA结合，这对于pr调控DNA的转录和pr翻译过程是必要的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成α-螺旋或β-折叠，就会出现相应的二级结构，aa残基带相同的电荷或侧链太大，都会妨碍二级结构的形成，此外还有一个分子伴侣的概念，其作用就是使肽链正确折叠，从而形成正确的空间构象。
　　（三）蛋白质的三级结构
　　指整条肽键中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。三级结构的形成和稳定主要靠疏水键、盐键、二硫键、氢键和范德华力等次级键。其中疏水键是最主要的稳定力量。疏水键是蛋白质分子中疏水基团之间的结合力，酸性和碱性氨基酸的R基团可以带电荷，正负电荷互相吸引形成盐键，与氢原子共用电子对形成的键为氢键。
　　分子量大的蛋白质三级结构其整条肽链中常可分割成多折叠得转为紧密的结构域，实际上结构域也是一种介于二级和三级结构之间的结构层次，每个结构域执行一定的功能。
　　（四）蛋白质的四级结构
　　蛋白质的四级结构是由有生物活性的两条或多条肽链组成，肽链与肽链之间不通过共价键相连，而由非共价键维系。每条多肽链都有其完整的三级结构，称为蛋白质的亚基，这种蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。在四级结构中，各亚基之间的结合力主要是疏水作用，氢键和离子键也参与维持四级结构。含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。
　　七、蛋白质结构与功能的关系
　　(一)蛋白质一级结构与功能的关系要明白三点：
　　1.一级结构是空间构象和功能的基础，空间构象遭破坏的多肽链只要其肽键未断，一级结构未被破坏，就能恢复到原来的三级结构，功能依然存在。
　　2.即使是不同物种之间的多肽和蛋白质，只要其一级结构相似，其空间构象及功能也越相似。
　　3.物种越接近，其同类蛋白质一级结构越相似，功能也相似。
　　但一级结构中有些氨基酸的作用却是非常重要的，若蛋白质分子中起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代，都会严重影响其空间构象或生理功能，产生某种疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。
　　(二)蛋白质空间结构与功能的关系
　　蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关。其构象发生改变，功能活性也随之改变。以肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)为例阐述蛋白质空间结构与功能的关系。
　　Mb与Hb都是含有血红素辅基的蛋白质。携带氧的是血红素中的Fe２+，Fe２＋有6个配位键，其中四个与吡咯环N配位结合，一个与蛋白质的组氨酸残基结合，另一个即可与氧结合。而血红素与蛋白质的稳定结合主要靠以下两种作用：一是血红素分子中的两个丙酸侧链与肽链中氨基酸侧链相连，另一作用即是肽链中的组氨酸残基与血红素中Fe2+
　　配位结合。
　　Mb只有一条肽链，故只结合一个血红素，只携带1分子氧，其氧解离曲线为直角双曲线，而Hb是由四个亚基组成的四级结构，共可结合4分子氧，其氧解离曲线为“S”形曲线，从曲线的形状特征可知，Hb第一个亚基与O2结合，可促进第二、第三个亚基与O2的结合，前三个亚基与O2结合，又大大促进第四个亚基与O2结合，这种一个亚基与其配体结合后，能影响蛋白质分子中另一亚基与配体结合能力的效应，称协同效应，O２与Hb之间是促进作用，称正协同效应。之所以会有这种效应，是因为未结合O2时，Hb结构紧密，此时Hb与O2亲和力小，随着O2的结合，其亚基之间键断裂，空间结构变得松弛，此种状态Hb与O2亲和力即增加。
　　这种一个氧分子与Hb亚基结合后引起亚基构象变化的效应称变构效应，有关此效应会在后面酶一章中详细解释。肌红蛋白只有一条肽链，不存在协同效应。
　　由此可见，Hb与Mb在空间结构上的不同，决定了它们在体内发挥不同的生理功能。
　　八、蛋白质的理化性质及其分离纯化
　　(一)蛋白质的理化性质
　　pr既具有aa的相关性质，又具有作为生物大分子的一些独特的性质。
　　1．蛋白质的两性电离及等电点，这与aa的性质相似，其氨基、羧基及侧链的某些基团皆可解离。
　　当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之带正电荷。体内各种蛋白质的等电点不同，但大多数接近于pH5.0，所以在人体体液pH7.4的环境下，大多数蛋白质解离成阴离子，带负电。
　　2．蛋白质的胶体性质
　　这是pr作为生物大分子才有的性质可将蛋白质溶液看作胶体溶液。pr作为溶液稳定存在的两大因素：一是蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；二是蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。
　　3．蛋白质的变性、沉淀和凝固
　　这也是pr区别于aa的特有性质。
　　(1)变性：蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为变性。一般认为蛋白质变性并不涉及一级结构的改变，故若蛋白质变性较轻，在去除变性因素后，其仍可恢复原有的构象和功能，称复性。但若其空间构象遭到严重破坏，则去除变性因素也不能复性，称不可逆变性。引起变性的因素有各种物理或化学因素。蛋白质变性后因其空间结构受到破坏，其性质也受影响，如易沉淀，粘度增加，作为酶其催化活性丧失等。虽然变性后蛋白质失去水化膜，其疏水侧链暴露，但只要其溶液pH值不等于蛋白质酶等电点，蛋白质仍可不沉淀，故变性后，蛋白质溶解度减少却并不一定沉淀。
　　医学上消毒灭菌，就是基于蛋白质变性的原理，而生物制品的制备和保存则必须防止蛋白质变性。
　　（2）沉淀：蛋白质在溶液中的稳定因素是水化膜及电荷，因而凡是能消除蛋白质表面的水化膜并中和电荷的试剂均可以引起蛋白质的沉淀。常用的有中性盐、有机溶剂、某些生物碱试剂、大分子酸类及重金属盐类等。
　　（3）凝固：蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强碱或强酸溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶于强酸和强碱中，如再加热则絮状物可变成较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸与强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。如鸡蛋煮熟后本来流动的蛋清变成了固体，实际上凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。
　　4蛋白质的紫外吸收。
　　由于蛋白质分子中含有有共轭双键的酪氨酸、色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰，这与aa相似。在此波长范围内，蛋白质的吸收光度值与其浓度成正比关系，因此可作蛋白质定量测定。
　　5蛋白质的呈色反应
　　①茚三酮反应：与氨基酸作用原理相似。
　　②双缩脲反应：肽键+硫酸铜――&稀碱溶液 紫色、红色物，氨基酸不出现此反应，故可检测蛋白质水解程度。
　　（二）蛋白质的分离与纯化
　　蛋白质的分离纯化过程就是巧妙利用蛋白质分子在大小、形状、所带电荷种类与数量、极性与非极性氨基酸比例、溶解度、吸附性质以及对其他生物大分子亲和力上的差异，将杂蛋白除去的过程，即利用蛋白质物理、化学性质的差异，将不同的蛋白质采用恰当的方法分开，常用的方法如下：
　　1.根据蛋白质两性电离及等电点分离的方法：
　　①等电点沉淀法：因为蛋白质在其等电点的pH值附近易沉淀析出，故利用各种蛋白质等电点的不同，即可将蛋白质从混合溶液中分开。
　　②电泳：指蛋白质在一定pH情况下带电荷，在电场中能由电场一极向另一极移动的现象。这实际上也利用了蛋白质分子、形状的不同，因为游动快慢与蛋白质所带电荷的性质、数目、分子、形状有关，对带相同性质电荷的蛋白质来说，带电多、分子小及为球状分子的蛋白质游动速率大，故不同蛋白质得以分离。根据支撑物不同，可分为薄膜电泳和凝胶电泳等。不同支持物，分辨率不同，如正常人血清蛋白电泳仅分出五条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分出30多条带。电泳结束后，用蛋白质显色剂呈色，即可看到一条条已经分离的蛋白质条带。③离子交换层析：在某一特定pH值时，混合蛋白质溶液中各种蛋白质所带电荷数目及性质不同，事先在层析柱中装上离子交换剂，其所带电荷性质与蛋白质电荷性质相反，当蛋白质混合溶液流经层析柱时，即可被吸附于柱上，随后用与蛋白质带相同性质电荷的洗脱剂洗脱，蛋白质可被置换下来，由于各种蛋白质带电量不同，离子交换剂结合的紧密度不同，带电量小的蛋白质先被洗脱下来，增加洗脱液离子强度，带电量多的也被洗脱下来，可将蛋白质分离。
　　2利用蛋白质分子量不同分离的方法
　　①透析：利用特殊膜制成透析袋，此膜只允许小分子化合物透过，而蛋白质是高分子化合物故留在袋内，故把袋置于水中，蛋白质溶液中的小分子杂质可被去除，如去除盐析后蛋白质中混杂的盐类。也常利用此方法浓缩蛋白质。即袋外放吸水剂，小分子的水即可透出，蛋白质溶液可被浓缩。
　　②分子筛：也叫凝胶过滤，是层析的一种。层析柱内填充带有网孔的凝胶颗粒。蛋白质溶液加于柱上，小分子蛋白进入孔内，大分子蛋白不能进入孔内而直接流出，小分子因在孔内被滞留而随后流出，从而蛋白质得以分离。
　　③超速离心：蛋白质胶体溶液与氯化钠等真溶液不同之处在于：蛋白质在强大离心场中，在溶液中会逐渐沉降，各种蛋白质沉降所需离心力场不同，故可用超速离心法分离蛋白质及测定其分子量，因其结果准确又不使蛋白质变性，故是目前分离生物高分子常用的方法。
　　3.与蛋白质的沉淀的性质相关的分离方法：
　　①盐析：硫酸铵、硫酸钠等中性盐因能破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离，如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱和硫酸铵中才会沉淀。盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。
　　②丙酮沉淀：丙酮可溶于水，故能与蛋白质争水破坏其水化膜，使蛋白质沉淀析出，在pH值和离子强度适当的情况下更佳，但丙酮使蛋白质变性，故应低温快速分离，还可用其他有机溶剂。
　　③重金属盐沉淀：因其带正电荷，可与蛋白质负离子结合形成不溶性蛋白盐沉淀，可利用此性质以大量清蛋白抢救重金属盐中毒的人。
　　(三)多肽链中氨基酸序列分析
　　主要步骤及原理如下：
　　1纯化蛋白质：用于序列分析的蛋白质应是分子大小均一，电游呈现一条带具有一定纯度的样品。
　　2分析蛋白质的氨基酸组成：用酸、碱等将蛋白质肽链水解为游离氨基酸，再用电泳、层析等方法分离、鉴定所有游离氨基酸的种类和含量，现在可用氨基酸自动分析仪来快速测定。
　　3.测定肽链中N末端和C末端为何种氨基酸；若蛋白质由两条以上肽链组成，通过末端氨基酸的测定还可估计蛋白质中的肽链数目。
　　①N末端氨基酸测定：二硝基氟苯、丹磺酰氯都可与末端氨基反应，再用盐酸等将肽链水解，将带有二硝基氟苯或丹磺酰氯的氨基酸水解下来，即可分离鉴定出为何种氨基酸，因丹磺酰氯具强烈荧光更易鉴别。
　　②C末端氨基酸测定：用相应的羧肽酶将C末端氨基酸水解下来，因各种羧肽酸水解氨基酶的专一性不同，故可对C末端氨基酸做出鉴定。
　　4.将链间、链内二硫键打开，否则会阻碍蛋白水解溶剂的作用，常用巯基化合物还原法。 5.选择适当的酶或化学试剂将肽链部分水解成适合作序列分析的小肽段，常用的方法有： ①胰蛋白酶法：水解赖氨酸或精氨酸的羧基形成的肽键，故若蛋白质分子中有4个精氨酸或赖氨酸残基，可得5个肽段。
　　②胰凝乳蛋白酶法：水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键
　　③溴化氰法：水解甲硫氨酸羧基侧的肽键。
　　6.测定各肽段的氨基酸排列顺序：
　　一般采用Edman降解法。
　　因PITC(异硫氰酸苯酯)只与N末端氨基酸作用，用冷稀酸将此末端残基水解下来，鉴定为何种氨基酸衍生物，残留的肽段N末端可继续与PITC反应，依次逐个鉴定出氨基酸的排列顺序。
　　7.多肽链用两种方法分别裂解成几组肽段，并测定每一方法中每一肽段的氨基酸排列顺序，肽段重叠法确定整条肽链的氨基酸顺序，若用两种方法找不出重叠肽段，就需用第三种、第四种方法，直到找出重叠肽段。
　　8.确定二硫键位置：
　　用电泳法将拆开二硫键的肽段条带与未拆开二硫键的条带进行对比即可定位二硫键的位置。
　　如此以来，一个完整蛋白质分子的一级结构即可被测定。
　　(四)蛋白质空间结构测定
　　常用的方法有X射线晶体衍射法和二维核磁共振技术，还可根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构。
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