研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经_____ 获得内皮抑素基因，再经_____ 进行扩增，以获得更多的目的基因。（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体_____ 连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有_____ 和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成_____ 颜色的菌落，原因是_____ 。（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。
粗提表达产物浓度/(μg·mL－1)
活的内皮细胞数目(×102)
实验结果说明_____ _____ 。
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研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经_____ 获得内皮抑素基因，再经_____ 进行扩增，以获得更多的目的基因。（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体_____ 连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有_____ 和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成_____ 颜色的菌落，原因是_____ 。（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。
粗提表达产物浓度/(μg·mL－1)
活的内皮细胞数目(×102)
实验结果说明_____ _____ 。
研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经_____ 获得内皮抑素基因，再经_____ 进行扩增，以获得更多的目的基因。（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体_____ 连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有_____ 和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成_____ 颜色的菌落，原因是_____ 。（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。
粗提表达产物浓度/(μg·mL－1)
活的内皮细胞数目(×102)
实验结果说明_____ _____ 。
科目:最佳答案见解析解析
（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经反转录(或逆转录)获得内皮抑素基因，再利用PCR技术进行体外扩增，以获得更多的目的基因。（2）双酶切后，目的基因两端的黏性末端不同，被切开的运载体两端的黏性末端也不同，这样可以避免目的基因与载体反向连接，还能减少目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有IPTG、X－gal和氨苄青霉素。因为重组质粒的LacZ基因中插入了目的基因，使LacZ基因不能表达出β－半乳糖苷酶，所以成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成白色菌落。（4）由表中数据可知，粗提表达产物浓度越高，活的内皮细胞数目越少，说明重组内皮抑素(或粗提表达产物)能够抑制毛细血管内皮细胞的增殖。分析：
考点1：基因工程、生物技术的安全性和伦理问题
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枯草芽孢杆菌bioW基因在大肠杆菌中的表达及其对宿主生长的抑制作用
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噬菌体结构有何特点?
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噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称.本世纪初在葡萄球菌和志贺菌中首先发现.噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小.噬菌体基因组含有许多个基因,但所有已知的噬菌体都是细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖.一旦离开了宿主细胞,噬菌体既不能生长,也不能复制.噬菌体分布极广,凡是有细菌的场所,就可能有相应噬菌体的存在.在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中,常含有肠道菌的噬菌体.在土壤中,可找到土壤细菌的噬菌体.噬菌体有严格的宿主特异性,只寄居在易感宿主菌体内,故可利用噬菌体进行细菌的流行病学鉴定与分型,以追查传染源.由于噬菌体结构简单、基因数少,是分子生物学与基因工程的良好实验系统.噬菌体颗粒在结构上有很大差别,一般可分成三种类型,即无尾部结构的二十面体,有尾部结构的二十面体和线状体,迄今已知的噬菌体大多数是有尾部结构的二十面体.噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几百个子代噬菌体颗粒,每个子代颗粒又可感染细菌细胞,再生成几百个子代噬菌体颗粒.如此重复只需4次,一个噬菌体颗粒便可使几十亿个细菌感染而死亡.当把细菌涂布在培养基上,长成一层菌苔时,一个噬菌体感染其中一个细菌时,便会同上面所说的那样,把该细菌周围的成千上万个细菌感染致死,在培养基的菌苔上出现一个由于细菌被噬菌体裂解后造成的空斑,这便称为噬菌斑(plaque).每一噬菌体除了能使宿主细菌裂解死亡外,还有一些噬菌体感染细菌后,并不使细胞死亡,称为温和噬菌体,这些噬菌体感染细菌后,将其自身的基因组整合进宿主细胞的基因组,此时,这种宿主细菌称为溶原性细菌.溶原性细菌内存在的整套噬菌体DNA基因组称为原噬菌体(prophage),溶原性细菌不会产生许多子噬菌体颗粒,也不会裂解；但当条件改变使溶原周期终止时,宿主细胞就会因原噬菌体的增殖而裂解死亡,释放出许多子代噬菌体颗粒.溶原性细菌有两个特点.第一,溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后,不会被同种噬菌体再次感染,这是超感染免疫性.第二,经过若干世代后,溶原性细菌会开始进入溶菌周期,即溶原性细菌的诱发.此时,原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖.λ噬菌体载体不具有质粒载体的抗生素抗性的标记基因；因此,对λ重组分子的选择主要有下面几种方法.① cI基因功能选择 cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态.如果在插入型载体的克隆位点上,或是置换型载体的可置换片段中,放上一个cI基因,当外源DNA插入或取代时,便破坏了cI基因,使出现cI-表型.此时,λ重组分子生成的是透亮的噬菌斑,而未重组的λ噬菌体由于仍保有cI基因,所以宿主细菌是溶原化的,就生成混沌的噬菌斑.②lac Z基因功能选择 lac Z基因的产物为卢—半乳糖苷酶,在Xgal—IPTG培养基上显现蓝色.在插入型载体的lac Z基因序列中引入限制性内切核酸酶的切点,外源DNA插入这个克隆位点就会破坏lac Z基因,于是在上述培养基上出现无色的噬菌斑.如果没有同外源DNA形成λ重组分子,则lac Z基因未遭破坏,在培养基上出现蓝色的噬菌斑.③spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌中正常生长,red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长.当置换型载体的可置换片段中放上red和gam基因后,外源DNA片段取代了置换片段,则同时除去了red、gam基因,就可在宿主菌中生长,否则就不能正常生长.
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噬菌体结构很简单，由蛋白质外壳和内部的DNA组成。侵染细菌的时候将DNA注入细菌体内，在细菌体内进行DNA复制，利用细菌的蛋白质合成子代噬菌体。
只有蛋白质和DNA组成>
噬菌体特性： 1．个体微小，无细胞结构，但具有一定的形态结构。 2．具严格的活组织寄生性。 3．这种寄生性具有高度的特异性。
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来源：《微生物学》
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