③有机成分母液的配制；MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应；亦可配制成混合母液，配制的步骤为：确定母液的浓度；④铁盐母液的配制；铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：；确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→；用时每配lL培养基取该溶液5ml；⑤植物生长调节物质母液的配制；对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg?；⑥其他常用试剂的配制
③有机成分母液的配制
MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
亦可配制成混合母液，配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
④铁盐母液的配制
铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8 →定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
用时每配l L培养基取该溶液5ml。
⑤植物生长调节物质母液的配制
对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg?ml-1或 ppm （parts per million，即百万分的浓度，指一百万份重量的溶液中，所含溶质的份数）较为方便，一般配制成0.5mg?ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
⑥其他常用试剂的配制
盐酸（lmol?L-1 ）：用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制
氢氧化钠（lmol?L-1 ）：用固体氢氧化钠配制
75%酒精(v/v) ：用95%的酒精来配制
配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。
母液最好在2～4℃的冰箱中保存。尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。 贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。
II、胡萝卜愈伤组织诱导培养基配制
1、 药品及用具的准备
（1）、 MS培养基母液的准备
配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。 MS培养基母液包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。
（2）、实验用具的准备
将洁净的各种用具如三角瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸、封口膜、橡皮筋、电炉等准备好放在指定的位置。再将蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、1mol?L-1NaOH、1mol?L-1HCl准备好。
2、培养基的配制步骤
（１）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.７～0.８％），撕碎后放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。
（２）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸馏水至所需体积。
（3）、调节培养基的酸碱性至PH5.8
由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。培养基若偏酸时用lmol?L-1 NaOH来调节，偏碱则可用lmol?L-1
HCl来调节。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。
（4）、培养基的分装
配制好的培养基要趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分注，口大者直接加注。试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。
（5）、培养基的灭菌
培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kg?cm-2或0.106 MPa，121℃时保持15～30 min左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的办法：（1）可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；（2）也可采用先关闭放气阀，待压力升到0.35kg?cm-2或0.037 MPa，108℃时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。
培养基灭菌时应注意：培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
3、无菌蒸馏水和接种工具准备
在250ml培养瓶中加入100ml蒸馏水，封口包扎；分别取枪状镊子2把、眼科手术剪和手术刀各1把，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；每套培养皿内放入合适滤纸2～3张，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；然后和培养基一起统一灭菌。
III、胡萝卜愈伤组织的诱导
（1）胡萝卜愈伤组织的诱导
①准备工作
A. a 接种室的清洁和消毒；b 超净工作台的开机和消毒；c 消毒溶液、无菌水、装
材料的容器、剪刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。
B. 实验材料的准备：
a 准备新鲜健康的胡萝卜根作实验材料；
b 实验材料的修整、刷洗、冲洗；
c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。
②植物材料的表面灭菌
A 操作人员洗手消毒（注意问题？）
B 装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒
C 将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒，取出用无菌水冲洗干净。
D 倒入消毒剂并计时
E 到预定时间后倒出消毒液并用无菌水清洗干净。
将材料切块后接种到诱导培养基上。
（2）胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制
配方：MS基本培养基＋ 2mg/L NAA＋0.1mg/L 6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋ 0.7％琼脂＋3％蔗糖
配制流程：同胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制
IV、胡萝卜愈伤组织的继代培养
（1）胡萝卜愈伤组织的继代培养
①准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于净工作台上）
②愈伤组织继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代诱导培养基上，放置在25 ℃全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
（2）胡萝卜细胞悬浮培养培养基的配制
配方：MS基本培养基 + 2.0mg/L NAA + 0.1mg/L6-BA + 200mg/L水解酪蛋白 + 3％蔗糖
配制流程：
二 、实验报告
1． 实验现象与结果
(1)、胡萝卜愈伤组织的诱导
在胡萝卜愈伤组织的诱导实验中，由于实验操作等方面的原因导致实验失败。在五瓶接种的三角瓶中，由于被细菌或真菌感染，导致实验材料死亡，实验失败。整个瓶内呈现黑褐色，且能够看见菌落等。
（2）、胡萝卜愈伤组织的继代培养
从上图可以看出，本次实验不是很成功。在两瓶增值的愈伤组织中，有一瓶被细菌或
真菌感染，从而导致实验失败。而另外一瓶虽然未呈现死亡现象，但是其继代结果不是很好，所增殖的愈伤组织细胞生长状况不良，而且增殖的细胞数很少。
2、 对实验现象、实验结果的分析及其结论
之所以会出现以上实验结果，可能是由于一下几点原因：
① 培养基、培养容器及各种接种器皿、器械灭菌不彻底
② 外植体灭菌不彻底
③ 操作时人为带入
④ 环境（接种室的环境、培养室环境）不清洁
⑤ 超净工作区域不清洁
⑥ 在实验前对个人卫生，没有认真清洁
3．实验总结
在此次实验过程中，由于老师的指导及严格要求，使自己提高了实验技能，熟练相关的实验操作，加深了对科研实验的理解，认识到在科学实验中必须严谨，否则一个小小的错误或者不规范的操作都会导致实验的失败。
在此次实验过程中，由于自己的不认真，马虎，对自己要求不严格，操作不规
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官方公共微信烟草遗传转化后的抑菌培养方法
申请号：.3 申请日：
摘要：本发明涉及一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、筛选培养、生根培养和抗性苗检测。采用本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法，培养容器和培养基都无需进行高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了烟草遗传转化后的培养环节，降低了烟草遗传转化后的培养成本；本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制后，再加上抑菌剂即可，实用性强，推广性好；本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法与常规方法比较，可以降低成本10％以上。
地址： 350002 福建省福州市仓山区建新镇金山学区
发明(设计)人：
主分类号：
&实质审查的生效IPC(主分类):C12N
15/84申请日:
注：本法律状态信息仅供参考，即时准确的法律状态信息须到国家知识产权局办理专利登记簿副本。
&一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、筛选培养、生根培养、抗性苗检测，其特征在于：(1)抑菌剂的配制：称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后，加20％的次氯酸钠溶液100ml，加20g山梨酸钾，再加2g乳酸链球菌素，用蒸馏水定容到200ml；(2)培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为1‰～2‰的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；(3)农杆菌转化：选择携带hyg基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌(Agrobacterium?tumefaciens)菌株EHA105中，制成转化菌液，用转化菌液侵染烟草叶片；(4)培养基配制：共培养培养基为MS+0.5mg/L?BA+100μmol/L乙酰丁香酮+0.4～0.5ml/L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；筛选培养基为MS+0.1～0.5mg/L6?BA+30mg/L潮霉素+0.4～0.5ml/L抑菌剂+300mg/L?Timentin+30.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.4～0.5ml/L抑菌剂+300mg/L?Timentin+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6?BA，指6?苄氨基嘌吟；配制培养基时，先不加抑菌剂，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、加热至琼脂粉完全溶解，等温度降到40～50℃时，再按各培养基配方添加抑菌剂，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒处理的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；(5)共培养：将侵染后的材料从转化菌液中取出，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至共培养培养基中，在22℃黑暗条件下共培养3d；(6)筛选培养：将共培养后的材料移至筛选培养基中，培养室温度为28℃，光照12h，光照强度为1200lx；15d后部分愈伤组织分化出小芽并形成小苗；选取高于2cm的小苗转生根培养；(7)生根培养：将筛选培养获得高于2cm的小苗，分成单株接种至生根培养基中，20～30d可形成完整植株，即抑菌培养苗；培养室温度为28℃，光照12h，光照强度为1500lx；(8)抗性苗检测：取移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料，进行DNA提取、PCR检测，呈现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。
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