生物通报道：胚胎干细胞 (ES)是一种永生化细胞 ,在适宜培养条件下具有永久的自我更新能力并维持未分化状态、高端粒酶活性、正常核型、胚胎表面标志及多潜能转录因子的表达 ,如SSEA、OCT- 4、Nanog等。ES被认为可以提供一种理想的生物学平台 ,用于多方面的科学研究与临床应用 ,如药物筛选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。
现有人类胚胎干细胞的培养和诱导分化，都离不开动物源培养基，比如从实验鼠身上分离出来的结缔组织细胞和牛胚胎血清等。选择最优化的细胞培养基对于ES的研究及临床应用是至关重要的，生物通总结了最新的相关培养新方法，希望能帮助有这方面需要的研究人员找到更适合自己实验的培养方法。
多能干细胞培养目前存在一些问题，比如如何培养足够量的多功能干细胞，如何能避免培养人类干细胞的材料发生免疫反应。在培养人类干细胞的材料方面，近期来自麻省理工的研究人员发明了一种合成性基质，这种基质没有外来动物材料，能够使干细胞至少三个月保持活性并自我繁殖。而且，该合成性基质首次使得单细胞能够形成细胞集落。这一成果公布在Nature Materials杂志上。以往研究表明，基质表面的化学和物理特性，比如粗糙度、硬度、对水的亲和力等对干细胞生长有影响。研究人员创造了500种特性不同的聚合物并在上面培养干细胞，分析每个聚合物上面细胞的生长状况。他们发现，基质表面疏水性对细胞生长有个最佳范围，而表面糙度和硬度则没有太多影响。此外，他们调整最佳聚合物的组成为：高比例的丙烯酸酯，外面包裹玻连蛋白。 应用这种新的培养基质，研究人员成功实现了人类胚胎干细胞持续三个月的生长和分裂，并获得了大量的细胞。他们将进一步研究，争取将这种培养基质应用到其它类细胞。
另外针对如何能够培养足够量的多功能干细胞呢？来自俄亥俄州立大学研究人员研制出一种大批量生产胚胎干细胞（mass-producing embryonic stem cells）的新方法。
用传统的实验室方法生产干细胞不仅价格高，最主要的是不能满足日益增长的对人类胚胎干细胞的需要。研究人员在一种生物反应器（bioreactor）中培养小鼠胚胎干细胞。细胞数量在15天内扩增了193倍，实验尾期的细胞密度――反应器中的细胞数是用实验室传统方法得到的10-100倍，也就意味着多出数亿的干细胞。并且检测结果显示，bioreactor中的干细胞未分化程度更高，寿命更长。这种类型的大批量生产因为需要更少的设备和管理，因此干细胞生产成本降低了80%。
研究人员使用的bioreactor实际上是一种组织生长设备（tissue-growing device），能够用于培养成人干细胞，并且能够使研究人员对培养过程中的每个胚胎干细胞进行紧密跟踪。新型bioreactor有两个格室（chamber），一个格室内包含可以支持干细胞生长的高聚物螺纹，一个格室内含有液态培养基。这种液态培养基能够向干细胞传递炎症因子，维持干细胞未分化状态。实验过程中，研究人员分别在flask中（传统细胞培养方法）和bioreactor中的标准高聚物螺纹（strands of polymer threads，生物通编者译）上培养小鼠干细胞。用flask和用bioreactor培养干细胞的不同之处在于：细胞在bioreactor中能够向三维空间生长，而在flask的底部平面上只能向二维平面上生长。bioreactor培养的细胞相对于flask培养的细胞寿命长，因为细胞有更多的空间。
研究人员以两种蛋白为指标检测flask和bioreactor得到的细胞（蛋白的出现标志干细胞还没有分化）。检测结果显示，用bioreactor培养的细胞94%呈阳性，用flask培养的细胞85%呈阳性。
除此之外，以色列耶路撒冷哈达萨大学的研究人员开发出一种新的干细胞培养基，能让干细胞在更长时间内不分化。这项研究成果发表在《Nature Biotechnology》上。
为了保持hESC存活且具有多能性，研究人员通常在滋养层细胞（也就是一层小鼠胚胎成纤维细胞）上培养，或者在微载体上成簇培养。但是在这些基质上培养干细胞是相当昂贵的，而且培养物不能在很长时间内保持未分化状态，尽管所有必需的生长因子都存在。研究人员分析hESC簇分化成神经细胞，他们一直在使用Invitrogen的Neurobasal培养基。这种培养基能够在无滋养层的条件下长时间维持神经细胞的生长和正常表型。在研究过程中，研究人员注意到并非所有细胞都分化了。他们怀疑是培养基的选择导致了这种现象，于是他们开始集中精力研究培养基如何促进干细胞生长并抑制分化。为了验证他们的理论，研究小组定制了培养基。他们在Neurobasal培养基中加入了血清替代物，还加入了干细胞生长所需的蛋白，包括细胞外基质组分、神经营养因子、成纤维细胞生长因子2和活化素A。研究人员在常规的无血清培养基和定制培养基中培养了hESC。三个星期之后，定制培养基中存在更多的未分化hESC细胞。使用这种新的培养基，研究小组检验了三种不同的hESC系。他们利用荧光激活细胞分选（FACS）在7周和20周后分析了培养物，发现90%的细胞仍维持多能性。这项突破为在计算机化的自动系统中大规模扩增胚胎干细胞创造了可能性。此外，通过改变培养条件，还可能进一步指导干细胞长成特定的细胞类型，用于研究或病人的移植。
（生物通：万纹）附：
胚胎干细胞培养标准化操作规程一般培养――维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGRO 复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。冻存细胞冻存液90％HS和10％二甲基亚砜步骤：1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2．用细胞刮刀收集细胞；3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）5．分装于冻存管内，每管1ml；6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。明胶包被准备500ml 0.1％明胶溶液1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。包被培养板或培养皿1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；2．置室温30分钟；3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。
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　　干细胞上市公司
　　编者按：中国证券报记者获悉，于2013年3月下发征求意见稿的《干细胞临床试验研究管理办法(试行)》、《干细胞临床试验研究基地管理办法(试行)》和《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则(试行)》，有望最快于今年7月份发布正式文件，慢则可能延续至年底发布。截至6月18日，上述三大监管法规的专家评审会已召开两轮，有望在6月底上部长办公会讨论，会后该政策的落地很快会有进展。
　　中国干细胞产业化正在提速步入快车道，而这套制度将对干细胞临床应用研究比照国家一类新药进行管理，可以填补国内干细胞产业监管的空白。在A股上市公司中，中源协和(行情,问诊)、冠昊生物(行情,问诊)、复星医药(行情,问诊)涉及干细胞治疗业务。
　　充满希望的&生命银行&
　　干细胞，如今炙手可热。13年前，日，刚刚出生的婴儿季依忱的脐血被存放进天津脐血干细胞库-196℃的液态氮中，标志着我国第一家自体存储者的脐血干细胞库开始运行。
　　什么是干细胞?干细胞在维护人类生命健康方面有哪些作用呢?据业内专家丁也介绍，干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体组织器官的祖宗细胞。造血干细胞是血细胞的种子，是各种血细胞的起源细胞。体内所有的血细胞，包括红细胞、白细胞、血小板等，都由它分化发育而来。造血干细胞具有自我更新和复制能力，即产生新的造血干细胞以自我补充，从而生生不息。造血干细胞存在于骨髓及胚胎的肝、外周血、脐带血中。
　　干细胞的最佳移植源来自脐血，脐血是指新生婴儿脐带在被结扎后胎盘内由脐带流出的血。虽然每个婴儿脐带中只有少量的血，但这些血液中却含有大量的未成熟的造血干细胞。与成年人干细胞相比，零岁婴儿未成熟造血干细胞的异体排斥反应小、免疫原性低，再生能力和速度是前者的10到20倍。
　　&脐血中富含造血干细胞，这些干细胞可以替代骨髓和外周血干细胞，移植治疗许多不治之症。&丁也介绍，干细胞是一种可以直接用来治病的&材料&，干细胞临床移植对白血病、再生障碍性贫血、癌症、严重免疫性疾病、放射病等重症绝症有治疗作用。目前从人体骨髓、外周血和脐血中获得的干细胞已广泛应用在移植中，骨髓干细胞移植在临床上治疗恶性血液病和遗传性疾病已开展几十年，外周血和脐带血干细胞移植也有10多年的历史，实用效果明显。
　　从发展趋势来看，干细胞技术将为心血管性疾病、糖尿病、早老性痴呆症、帕金森病和骨髓受损患者带来希望，或促使一种全新的&再生医学&出现，使目前只能靠药物维持的多种疾病患者得到根本治愈。从品种方面看，脐带血移植效果好，其产生的副反应少而且经济。但由于脐血移植需要配型，非亲属之间的配型完全相同者概率很低，因此有必要对脐血进行储存以备急需之用，这就相当于有了&生命备份&。
　　采集脐血的过程对母亲和胎儿都非常简单而且没有危险。婴儿出生之后，脐带两头立即被结扎，同时将婴儿和脐带分开，由医生抽出脐带血。这一过程只需几分钟，而且不需要进行麻醉，无痛无副反应，在大多数妇产科医院皆可完成。
　　丁也介绍，目前我国在干细胞领域的研究技术基本与世界前沿技术同步。中国医学科学院血液学研究所是国内干细胞领域的权威研究机构，附设的血液病医院是国内一流的血液病医院，自1986年起就开始探讨通过移植方式治疗血液顽症，是我国最早开始从事骨髓移植的两个医院之一。
　　产业链格局三部曲
　　当前，干细胞疗法正处于大规模深度产业化的黎明阶段，各种颠覆性技术陆续突破，各种产业化尝试如雨后春笋。
　　根据Visiongain提供的市场调研数据，2011年干细胞疗法的市场份额达27亿，市场主要由骨髓干细胞移植(BMT)构成。同时，干细胞银行和配套产品的市场份额达26亿美元。预计到2016年，市场份额将达88亿美元(年的年复合增长率为10.6%)。
　　&以干细胞治疗为核心的再生医学，将成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径，从而将会成为新医学革命的核心。&这是科技部发布的《干细胞研究国家重大科学研究计划&十二五&专项规划》对干细胞治疗做的评估。这实际上也是中国政府对干细胞治疗的基本认识。
　　&我国干细胞产业链条分为上、中、下游3种不同的商业模式，产业链上的各家企业在其业务上也各有侧重。&中国医学科学院医学信息研究所钟华在《中国医药(行情,问诊)生物技术》撰文指出，产业链的上游主要是干细胞的采集及存储业务，中游是干细胞技术研发，下游是干细胞移植及治疗。
　　钟华介绍，产业链上游企业以干细胞采集和存储业务为主，其主要业务模式为脐带血干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、牙齿、经血、羊膜等干细胞物质的采集及贮存。代表企业如中源协和的天津市脐带血造血干细胞库，上海干细胞技术有限公司的上海脐带血造血干细胞库等。
　　脐血造血干细胞库存储业务之所以得到规模化开展，主要是近年来研究发现新生儿脐带血中含有丰富的造血干细胞，将脐血干细胞移植，一方面可以抵制白血病等恶性血液病治疗过程中放疗、化疗产生的副作用，另一方面也可缩短患者造血功能恢复的时间。目前脐血主要用于对儿童造血干细胞移植治疗。
　　钟华介绍，除了脐血造血干细胞库外，近年来间充质干细胞库也逐渐发展起来，如深圳市间充质干细胞库、山东省人类脐带间充质干细胞库等。相对于脐血干细胞主要用于治疗血液和免疫系统疾病，脐带间充质干细胞具有更强的医疗应用潜能，它可以分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞以及脂肪细胞等，在细胞治疗、组织器官修复和基因治疗等方面都显示出应用潜力。随着脐带间充质干细胞研究的不断深入，消费者治疗需求也在不断增加，成为未来干细胞存储业务的市场发展点。
　　中游企业从事干细胞增殖、干细胞制剂的研发，为研发组织和个人提供干细胞，用于疾病的发病机制研究和新型药物研制。这些企业以输出干细胞治疗技术为主，主要针对脑瘫、脊髓损伤、视神经发育不全、遗传性共济失调等神经系统疾病、糖尿病以及肌营养不良等疑难疾病提供干细胞治疗技术。这些企业通过向医院提供干细胞技术体系并收取技术服务及技术使用权转让费获得收益，或者通过为患者提供个体化治疗，再按照一定的比例与医疗机构分享治疗费用。此类企业主要有深圳市北科生物科技有限公司、吉林省中科生物工程有限公司等。（南方财富网个股频道）
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