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【求助】抗凝静脉血提取白细胞
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这个帖子发布于5年零357天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我在检验科工作，最近做课题的需要，要从EDTA抗凝静脉血中先用低速离心机分离血浆，然后再从中分离白细胞将来准备提取DNA，曾经用蒸馏水破坏红细胞然后普通高速离心机分离出白细胞，但效果不好，怎么处理才能将细胞处理的更完美
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1、要想得到单个核细胞，就用淋巴细胞细胞分离液分离，效果非常好：在吸取血浆的全血球中加入等量的生理盐水后混匀加置非离液表面，1500转离心15分钟，唾吸取单个核细胞层的细胞悬液，用生理盐水洗一次即可。2、要想得到全部白细胞，就用氯化铵溶血法原理：NH4离子可以透过细胞膜进入，提高了红细胞的渗透压，导致细胞吸水、膨胀，最终破裂，造成溶血。方法：（1） 取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10 min。（2） 小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。（3） 在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15 min。（4） 2500rpm离心10 min，弃上清。（5） 加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15 min。（6） 3000rpm离心10 min，弃上清。（7） 倒置离心管，去掉残液。（8） 得白细胞，－80?C冻存。
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我现在从人外周血提中性粒细胞为什么总是有红细胞污染白细胞？这是我的实验步骤：取新鲜抗凝血2.5ml，与人中性粒细胞1：1混匀后加入15ml离心管中，以300转/分，离心15分钟，去上清液及所有的白颜色细胞层（但是我去的时候总是取到红细胞，据说白细胞是在红细胞上面薄薄的一层），弃去所有红细胞（这步还是上面说的，并不能把所有的红细胞都弃去，着急啊），然后将取得的上清液及所有的白颜色细胞层混匀液小心加于5ml分离液的液面上，以1800转/分离心15分钟，按理说，第一层为血浆或组织匀浆液层，第二层为环状乳白色细胞，第三层为浑浊分离液层（包含部分中性粒细胞）和中性粒细胞层，我收集了第三层，将其放入细胞洗涤液10ml的离心管中，充分吹匀后，2000转/分离心20分钟，后弃去洗涤液，留下管尖处的细胞（应该只有白色细胞，而我提出来的之前说过有红细胞污染，在我这里就是有红细胞和白细胞，而且红细胞的量大大的多于白细胞的量）在加入10ml洗涤液离心2000转/分钟，20分钟，后弃去洗涤液，加入5ml培养液，吹匀后，转入培养瓶中观察。唉，观察的全是红细胞啊，失败的不知各位大虾有什么高招没，给小的指点指点，千恩万谢啊
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检验烦人 我在检验科工作，最近做课题的需要，要从EDTA抗凝静脉血中先用低速离心机分离血浆，然后再从中分离白细胞将来准备提取DNA，曾经用蒸馏水破坏红细胞然后普通高速离心机分离出白细胞，但效果不好，怎么处理才能将细胞处理的更完美怎么能用蒸馏水呢？用它不但红细胞碎了，所有的白细胞都碎了。有专门的红细胞裂解液，用它就可以。如果你分析的对象是白细胞，那只能用这种方法，如果你的分析对象是不包括中性粒细胞的PBMC，则可以用Ficoll密度梯度离心法，效果较好。
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【求助】求教如何从人类全血中提取白细胞
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求教各位大侠，谁有从全血中提取白细胞的实验过程啊？
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求教各位啊，急呀
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如果是提取包括粒细胞的全部白细胞，直接破红处理就可以了。如果是提取不包括粒细胞的PBMC，用Ficoll密度梯度离心法。
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看你取白细胞做什么用呢？
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huyanhua1981 看你取白细胞做什么用呢？就做PCR看基因表达
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哦 别的细胞里有没有这个基因呢？如果别的细胞有影响的话那可能要求就高了
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如何从新鲜血液中分离出白细胞
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以下是我们实验室沿用的方面：1 淋巴细胞分离液提取白细胞⑴抽取外周血3ml（EDTA抗凝），缓慢加入已有3ml淋巴细胞分离液的10ml玻璃离心管中。⑵1,000rpm室温离心15分钟。⑶吸中层白细胞至1.5ml的离心管中。⑷１4, 000离心3?5分钟。⑸弃上清，所留的白色沉淀即为淋巴细胞。⑹用400μlTE悬浮淋巴细胞。⑺加4μl10%SDS，８μl蛋白酶Ｋ（20mg/ml）⑻55℃水浴4小时。2 基因组DNA的抽提⑴加RNA酶（10mg/ml）5μl至提取的白细胞中。⑵37℃水浴1小时。⑶加等体积饱和酚，倒置摇匀，使水相和酚相充分混合。⑷14，000rpm离心15分钟。此时DNA溶液在上层，酚相位于下层，中层是变性蛋白层。⑸小心吸取上层粘稠溶液至另一1.5ml离心管，再加等体积饱和酶抽提一次。⑹加等体积的氯仿/异戊醇按上述步骤抽提两次。⑺吸上层水相至另一1.5ml离心管中，加入倍体积的无水乙醇（预冷），此时可见网状DNA白色沉淀。⑻置-20℃冰箱过夜，沉淀DNA。⑼14，000rpm离心15分钟，弃上清，让残存的乙醇室温中挥发。⑽加入0.2mlTE溶解DNA，-20℃保存。
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用淋巴细胞分离液即可，将新鲜血液用等量PBS稀释，再一个新管子里加入稀释后血液1/3体积的的淋巴细胞分离液，自然沉淀十分钟，2000RPM离心，吸出白色的细胞层即可，然后5000RPM离心10S，弃去上清，沉淀就是白细胞。
我以前就是这样做的，不知道你现在是否有了更好的办法？祝成功
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我是先6000rpm离心15min，倾倒血浆后再将白色细胞层到入另一离心管，加两倍体积双蒸水破坏红细胞，再6000rpm离心15min，重复一次。就可以得到白细胞沉淀了。你可以试试，效果不错。
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受用，你知道如何从白细胞层提取DNA吗？详细的方法
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将消化液一分为二，将其转入两个1.5mlEp中。加入等体积的饱和平衡酚，轻轻摇匀10min，12000r/min 离心15min，吸取上层水相于另一离心管中。用去头枪头吸出上层水相于另一离心管中，弃去下层苯酚。
加等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）轻轻摇匀10min，12000r/min 离心15min吸取上层水相于另一离心管中。加等体积氯仿/异戊醇（24：1），操作同上。加入两倍体积预冷的无水乙醇（-20℃），轻轻摇动离心管，即有DNA呈絮状析出。6000r/min离心5min，使DNA沉淀于离心管底部，弃去乙醇溶液。待DNA自然干燥后，加入30ulTE/管溶解DNA，置-20℃保存。
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gl640 受用，你知道如何从白细胞层提取DNA吗？详细的方法上海华舜有专门提DNA的盒子。不错
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以下是我们实验室沿用的方面：1 淋巴细胞分离液提取白细胞⑴抽取外周血3ml（EDTA抗凝），缓慢加入已有3ml淋巴细胞分离液的10ml玻璃离心管中。⑵1,000rpm室温离心15分钟。⑶吸中层白细胞至1.5ml的离心管中。⑷１4, 000离心3?5分钟。⑸弃上清，所留的白色沉淀即为淋巴细胞。⑹用400μlTE悬浮淋巴细胞。⑺加4μl10%SDS，８μl蛋白酶Ｋ（20mg/ml）⑻55℃水浴4小时。2 基因组DNA的抽提⑴加RNA酶（10mg/ml）5μl至提取的白细胞中。⑵37℃水浴1小时。⑶加等体积饱和酚，倒置摇匀，使水相和酚相充分混合。⑷14，000rpm离心15分钟。此时DNA溶液在上层，酚相位于下层，中层是变性蛋白层。⑸小心吸取上层粘稠溶液至另一1.5ml离心管，再加等体积饱和酶抽提一次。⑹加等体积的氯仿/异戊醇按上述步骤抽提两次。⑺吸上层水相至另一1.5ml离心管中，加入倍体积的无水乙醇（预冷），此时可见网状DNA白色沉淀。⑻置-20℃冰箱过夜，沉淀DNA。⑼14，000rpm离心15分钟，弃上清，让残存的乙醇室温中挥发。⑽加入0.2mlTE溶解DNA，-20℃保存。
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丁香园荣誉版主
1. 用Ficoll；2. 用Percoll。按说明书操作即可！
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丁香园荣誉版主
受用，你知道如何从白细胞层提取DNA吗？详细的方法Invitrogen公司的TRIZOL Reagent可同时从白细胞层提取RNA、DNA和蛋白质！
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为什么加入RNA酶？
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effiejason 用淋巴细胞分离液即可，将新鲜血液用等量PBS稀释，再一个新管子里加入稀释后血液1/3体积的的淋巴细胞分离液，自然沉淀十分钟，2000RPM离心，吸出白色的细胞层即可，然后5000RPM离心10S，弃去上清，沉淀就是白细胞。
我以前就是这样做的，不知道你现在是否有了更好的办法？祝成功这分离的是单个核细胞，只是白细胞的一部分。
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分离的只是淋巴细胞啊，只占白细胞的20%-45%，做实验的话能代表白细胞吗？
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