对照品（标准品）标定办法的选择要关注如下事项
　　对照品（标准品）标定办法的选择要关注如下事项：
　　(1)供试品的取用量应满足滴定精度的要求（消耗滴定液约20ml）：&&
　　(2)滴定终点的判断要明确，提供滴定曲线。如选用指示剂法，应考虑其变色敏锐，并用电位法校准其终点颜色。&&
　　(3)为排除因加入其它试剂而混入杂质对测定结果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用“将滴定的结果用空白试验校正”的办法；&&
　　(4)要给出滴定度（采用四位有效数字）的推导过程。
&&&&标定结果要根据3个以上实验室并不少于15组测定结果经统计分析，去除离群值和可疑值后的结果，并报告可信限。
&&&&如该药物没有可进行等当量换算并符合耍求的容量法时，可采用反复纯化的原料，色谱法确定纯度后扣除有关物质、炽灼残渣、水分和挥发溶剂等后的理论含量确定为标准品含量，以此为基准进行对照品（标准品）的换代和量值传递。
&&&&举个简单的例子，一个10g的样品中含没有吸收的盐0.2g，有吸收的有机物9.8g，在9.8g有机物中含成分A9那么测纯度时，由于没有吸收的盐不产生吸收峰，纯度为9.5/9.8=96.94%。
含量计算时，采用外标法，通过的峰面积计算含量，考虑了中间盐的因素，因此含量计算出来是在楼主描述的情况应该符合下面这段话的要求。
&&&&如该药物没有可进行等当量换算并符合要求的容量法时，可采用反复纯化的原料，色谱法确定纯度后扣除有关物质、炽灼残渣、水分和挥发溶剂等后的理论含量确定为标准品含量，以此为基准进行对照品（标准品）的换代和量值传递。
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银杏叶提取物 国际商务标准
文章来源：西安皓源生物技术有限公司 &&&&发布时间：&&&&作者：佚名
《银杏叶提取物 国际商务标准》
一、工作简况
本标准的制定工作，是由中国医药保健品进出口商会提出而进行的，由中华人民共和国商务部归口，中国医药保健品进出口商会标准化技术委员会负责解释。本标准由浙江康恩贝制药股份有限公司负责起草，北京绿色金可生物技术股份有限公司、晨光生物科技集团股份有限公司、重庆科瑞南海制药有限责任公司和上海诺德生物实业有限公司等单位复核。标准主要起草人为王如伟、方玲、姚建标、叶剑锋、姚德中、苏一多、章江生、雷凯琴、胡江宁、何厚洪、吴旭明、吴健、乔洪翔。
二、标准制订的目的及意义
银杏叶提取物(Ginkgo leaves extract)是以银杏叶为原料经提取分离制成的植物提取物，是我国乃至世界上重要的天然药物原料之一。中国是银杏的主产地，由于竞争激烈，各厂家生产设备及工艺水平参差不齐，部分银杏叶提取物厂家为了使产品主要化学指标符合客户标准，采用水提、半萃取，掺入银杏树皮、根皮与银杏叶共同提取，或掺入含有芦丁、槲皮素或山奈素结构的物质共同提取，使用甲醇、工业乙醇提取，这些不当的商业行为，不仅混乱了产品的质量构成，还严重干扰了市场秩序，损害了产品、行业乃至国家声誉，使得银杏叶提取物出口行业境况举步维艰。随着美国药典、欧州药典对EGB质量标准的修订和不断改进，国外企业在国内的银杏种植基地与产业基地逐步发展壮大，势必对我国的EGB行业构成实质性的冲击。目前，如何跟进美国药典、欧洲药典银杏叶提取物标准，提高国内EGB的标准，保证银杏叶提取物的质量稳定性，保证人民用药安全是第一紧迫任务。为了进一步规范国内银杏叶提取物在生产、贮存、运输过程中的质量管理，特制定本标准。
三、国内外有关法律法规和其他标准的关系
银杏叶提取物标准已收载于《中国药典》2010年版一部、USP36-N31和EP7.0。不同药典标准中，银杏总黄酮醇苷、银杏内酯及银杏酸的样品前处理方法、含量测定方法、含量计算方法及标准限度等方面均存在一定的差异。
四、标准的制订与起草原则
本标准遵循《中华人民共和国药品管理法》、现行版《国家药品标准工作手册》和《中国药品检验标准操作规范》的有关规定，参照《中国药典》2010年版、USP36-NF31和EP7.0中银杏标准、及GB 9685 食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准等，制定本标准。
五、确定各项技术内容
&&& 样品来源：银杏叶提取物主要由浙江康恩贝制药股份有限公司，样品批号为（等）；部分样品为市售银杏叶提取，样品批号为（等）；对照品芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果新酸、总银杏酸对照品、银杏叶对照提取物：中国食品药品检定研究院提供。
1 工艺要求
参照《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物标准，本品为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶经加工制成的提取物。其制法为：取银杏叶，粉碎，用乙醇和水一定比例混合溶液提取，浓缩，稀释，沉淀，经大孔吸附树脂吸附、洗脱，洗脱液回收乙醇，干燥，粉碎，过80目筛，即得。
2 感官要求
对本品三批样品，嗅其气味和尝其滋味；另取试样适量置于白色瓷盘中观察其色泽、外观，并检查有无异物，结果见表1
表1& 银杏叶提取物感官要求
浅棕黄色至棕褐色
浅棕黄色至棕褐色
浅棕黄色至棕褐色
气微，味微苦
气微，味微苦
气微，味微苦
均匀，无可见异物的粉末
均匀，无可见异物的粉末
均匀，无可见异物的粉末
根据观察结果，本标准规定银杏叶提取物的感官要求描述为：本品为浅棕黄色至棕褐色粉末；气微，味微苦；外观均匀，无可见异物。
3 理化指标
表2& 理化指标
检验方法来源
鉴别（1）、（2）
应符合规定
中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 （鉴别）
指标成分含量
总黄酮醇苷含量，%&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 （含量测定）：总黄酮醇苷
总萜类内酯含量，%&&&&&&
附录A2，参考美国药典（USP36-NF31）银杏叶提取物标准中银杏萜内酯测定的色谱条件和中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶总萜内酯测定的供试品制备方法；
黄酮苷元峰面积比
槲皮素与山奈酚峰面积比应为
美国药典（USP36-NF31）银杏叶提取物 （IDENTIFICATION）：B.HPLC
异鼠李素与槲皮素峰面积比&&
芦丁含量，%&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
附录A3，参考中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定方法，改变了流动相比例和供试品制备方法；
游离槲皮素含量，%&&&& &&&&&&&&&&&&&&&
附录A4，参考中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定方法，仅改变了供试品制备方法；
游离山奈酚含量，%&&&&&&&&&&&&&&&&&
游离异鼠李素含量，%&&&&&&&&&&&&&&&
总银杏酸含量，mg/kg&&&&&&&&&&&&&&&&&&
附录A5，检测方法参考中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物标准中银杏酸限度的检测，供试品制备方法及标准参考EP7.0银杏叶提取物中银杏酸限度检测方法的标准
粒度（80目筛通过率），%&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）二部附录Ⅺ B第二法
水分，%&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX H 水分测定法第一法
炽灼残渣，%&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX J
重金属（以Pb计），mg/kg&&&&&&&&&&&&&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX E
铅（Pb），mg/kg&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B
镉（Cd），mg/kg&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B
砷（As），mg/kg&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B
汞（Hg），mg/kg&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX B
按中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物【鉴别】项下要求：
鉴别（1） 取本品0.2g，加正丁醇15ml，置水浴中温浸15分钟并时时振摇，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取银杏叶对照提取物0.2g，同法制成对照提取物溶液。照薄层色谱法（药典附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各3μL，分别点于同一以含0.4 %醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5:3:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯（365mn)下检视。供试品色谱中，在与对照提取物色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
三批提取物鉴别结果见下图。
鉴别(2) 照薄层色谱法（药典附录VI B)试验，吸取〔含量测定〕项下萜类内酯的供试品溶液和对照品溶液各15μL，分别点于同一以含0.4 %醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇（10:5:5:0.6)为展开剂，在15°C以下展开，取出，晾干，用醋酐蒸气熏15分钟，在140~160°C加热30分钟，放冷，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
三批提取物鉴别结果见下图。
3.2 总萜类内酯含量测定&
银杏萜类内酯是银杏叶提取物中最重要的活性成分之一。对比国内外药典标准，针对内酯的含量检测，在检测器、样品前处理、色谱条件、含量计算方式等方面，均存在一定差异。
检测器方面：目前主要采用的检测器有ELSD（如Ch.P、USP）和折光仪检测器（如EP）两种，国内外很多报道的文献，大多采用ELSD检测器，因此本标准仍采用ELSD检测器来检测银杏叶提取物总萜类内酯。
含量计算方式方面：Ch.P标准采用外标两点法对数方程来分别计算各分内酯的含量；USP标准采用标准曲线法对数方程来分别计算各分内酯的含量；EP标准采用苯甲醇为对照分别计算各分内酯的含量（折光仪检测器，暂不考虑）。研究认为，Ch.P标准的两点法和USP标准的标准曲线法，本身并不存在太大差异，但是由于两点法受对照品浓度大小的限制，加之国内银杏叶提取物规格众多，容易出现同一个样品中，个别内酯测定的峰面积不在对照品相应两点范围内，如此计算所得结果准确性存在一定问题；同时，两点法所得k、b值的重复性，不如标准曲线法所得k、b值重复性好，测定误差相对较大。因此，为保证银杏叶提取物总萜类内酯测定结果更准确、可靠，本标准参考USP银杏叶提取物标准，采用标准曲线法对数方程来分别计算各分内酯的含量。
样品前处理及色谱条件方面：Ch.P2010银杏叶标准采用酸性氧化铝柱纯化，流动相甲醇-THF-水系统测定，银杏叶提取物标准采用乙酸乙酯萃取，流动相正丙醇-THF-水系统测定； USP标准采用硅藻土柱纯化，流动相甲醇-水系统梯度洗脱；EP标准采用硅藻土柱纯化，流动相THF-甲醇-水系统测定。本研究首先对供试品前处理方法进行了对比研究，供试品批号0318，结果如下表。
表3不同前处理方法对比
前处理方法
试剂来源、规格
总内酯含量/（%）
120204&&&& 120318
乙酸乙酯萃取
国药，分析纯
7.69&&&&& 7.01
硅藻土柱纯化
国药进口分装
7.78&&&&& 7.18
&&& 结果表明，乙酸乙酯萃取和硅藻土柱纯化相比，柱纯化测定结果相对含量稍高，总体上总内酯含量并没有太显著差异。由于萃取法操作步骤较多，过程比较复杂繁琐，柱纯化方法操作更便捷，在保证含量测定结果没有显著差异的情况下，优选柱纯化方法。采用同一批供试品（批号120204）对不同柱纯化填料进行了考察，结果见下表。
表4不同前处理填料对比
前处理方法
试剂来源、规格
填料用量/（g）
洗脱剂/用量
总内酯含量/（%）
硅藻土柱纯化1
乙酸乙酯/100mL
硅藻土柱纯化2
乙酸乙酯/100mL
硅藻土柱纯化3
国药进口分装
乙酸乙酯/100mL
酸性氧化铝柱纯化
国药，100-200目
对比不同填料，只有Agela厂家的硅藻土前处理测定结果偏低， Merck和国药进口分装的硅藻土处理测定的含量和酸性氧化铝处理（暂参考Ch.P银杏叶标准，酸性氧化铝3g，200-300目，柱内径1cm，甲醇湿法装柱；供试品取样0.15g，）测定结果均相近，没有显著性差异。相比于硅藻土，采用酸性氧化铝方法填料便宜，所用试剂量较少，检测成本较低。因此，对该填料开展了进一步研究（供试品批号120204），结果见下表。
表5填料用量比较
前处理方法
填料用量/（g）
洗脱剂/用量
总内酯含量/（%）
酸性氧化铝
表6洗脱剂用量比较
前处理方法
填料用量/（g）
洗脱溶剂/用量
总内酯含量/（%）
酸性氧化铝
上述结果表明，供试品取样0.15g，采用经活化的酸性氧化铝3g，湿法上柱，柱径1cm，再用甲醇40-50mL洗脱，可纯化样品，经HPLC-ELSD检测，各内酯分离度良好，含量准确。
综合上述研究结果，本标准参照USP银杏叶提取物标准和Ch.P银杏叶、银杏叶提取物标准，对银杏叶提取物总萜类内酯的检测方法进行了修改，验证结果如下。
照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VI D）测定
仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（ELSD检测器）
3.2.1 色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：Agilent Zorbax XDB C18 250×4.6mm 5uμm
流动相：流动相A 甲醇-流动相B 水按比例梯度洗脱（Post time：10 min）；
2548
7552
520
检测器：HPLC-ELSD
柱温：25 ℃；
流速：1.0 mL/min。
进样量：对照品溶液、供试品溶液各10μL。理论塔板数以白果内酯峰计算应不低于 2500。
3.2.2 供试品溶液制备
取本品 0.15 g，精密称定，加甲醇分次溶解，加入装有3 g酸性氧化铝的层析柱（酸性氧化铝：200-300目，经活化处理；层析柱：柱径0.8-1.0 cm），以甲醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，甲醇溶解并定容至5 mL量瓶，若有必要，可用超声波处理。用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。
3.2.3 对照品溶液制备
称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量（精确至0.01mg），加入甲醇溶解，制备得每1 mL含白果内酯 2.4mg、银杏内酯A 1.6mg、银杏内酯B 0.8mg、银杏内酯C 0.8mg的混合对照品甲醇溶液。再分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍，制备得到5份已知浓度的混合对照品溶液，浓度系列见表A2。标准使用溶液用 0.45 μm 微孔滤膜过滤后待测。
3.2.4 标准曲线试验
精确称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量，加甲醇超声溶解，制备混合内酯对照品浓配液。按比例稀释5个浓度的混合内酯对照品溶液，照含量测定项下的方法测定，经线性回归后得回归方程，结果见下表及图。
表7& 内酯标准曲线及线性范围
线性范围/ug
y = 1.476x + 2.133
1.67-25.13
y = 1.505x + 2.080
0.85-13.83
y = 1.356x + 2.073
0.86-13.01
y = 1.501x + 2.060
0.66-10.00
3.2.5仪器精密度试验
取上述混合内酯对照品溶液，连续进样5次，测定。各成分峰面积RSD均小于2%，仪器精密度良好。结果见下表。
表8& 仪器精密度试验(n=5)
3.2.6 重复性试验
取供试品（批号120204），于同一天内称取5份样品测定，按3.2.2制备供试品溶液，测定总内酯含量，结果见下表。
表9& 重复性试验(n=5)
总萜类内酯含量/（%）
&平均含量/（%）
3.2.7 中间精密度试验
取供试品（批号120204），在不同天内由不同人员取样、并用不同仪器测定5次，测定结果见下表。
表10& 中间精密度试验(n=5)
总萜类内酯含量/（%）
&平均含量/（%）
3.2.8 准确度试验
根据重复性试验测定结果，供试品120224总内酯含量为7.82%，含BB 3.16%、GC 1.04%、GA 2.38%、GB 1.24%。精密称取各银杏内酯对照品，加甲醇制成1 mL含BB 1.2mg、GC 0.4mg、GA 0.9mg、GB 0.45mg的混合内酯对照品贮备液。取本品（批号120204）约75mg，精密称定，等分为三组，各组分别加入对照品贮备液1.6mL、2.0mL、2.4mL，照3.2.2制备供试品溶液。照含量测定方法测定，计算回收率，结果见下表。
表11& BB加样回收率结果
样品取样量
样品中含量/mg
对照品加入量/mg
平均回收率
表12& GA 加样回收率结果
样品取样量
样品中含量/mg
对照品加入量/mg
平均回收率
表13& GB加样回收率结果
样品取样量
样品中含量/mg
对照品加入量/mg
平均回收率
表14& GC加样回收率结果
样品取样量
样品中含量/mg
对照品加入量/mg
平均回收率
测定结果显示，本方法四个内酯的回收率在98-100%之间，回收率RSD小于3%，故本检测方法准确度高，实际可行。
3.2.9 耐用性试验
本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了初步考察，色谱柱信息及测定结果如下图：
色谱柱1：Agilent XDB C18 250*4.6mm 5μm；
色谱柱2：Agilent SB C18 250*4.6mm 5μm；
色谱柱3：Kromasil 100-5- C18 250*4.6mm；
色谱柱4：Phenomenex C18 250*4.6mm 5μm ；
&&& 从上图可见，采用上述三个厂家四种色谱柱均可有效分离银杏内酯成分，而同品牌的色谱柱，C18 150×4.6mm 5μm的色谱柱对目标成分的分离度较差。为保证各内酯能够有效分离，建议采用C18 250×4.6mm 5μm 色谱柱，品牌方面，建议安捷伦（Agilent）；菲罗门（Phenomenon）。
3.2.10 结果计算&&&&&&
供试品中各萜类内酯组分含量以质量分数Xi计，数值以%表示，按公式（A1）计算，分别计算白果内酯、银杏内酯A 、银杏内酯B、银杏内酯C的百分含量。将各组分的百分含量累加计算总萜类内酯的百分含量，按公式（A2）计算。
………………………………（A1）
` & …………………………………（A2）
X1――供试品中总萜类内酯的质量分数，%；
Xi――某萜类内酯组分含量，%；
ci――从标准曲线中求得的供试品溶液中某组分含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
Vi――供试品溶液总体积，单位为毫升（mL）；
mi――供试品质量，单位为毫克（mg）。
3.2.11 样品测定
取本品0.15g，精密称定，按3.2.2和3.2.3制备供试品和对照品溶液，测定。分别计算分内酯和总内酯含量。
多批银杏叶提取物含量测定结果见下表。
表15 银杏叶提取物总萜类内酯含量测定结果
总萜类内酯/（%）
浙江康恩贝
浙江康恩贝
浙江康恩贝
市售提取物1
市售提取物2
市售提取物3
参考Ch.P2010银杏叶提取物标准，本标准规定银杏叶提取物中总萜类内酯含量不得低于6.0%。
3.3 黄酮苷元峰面积比
《中国药典》2010年版和USP32-NF27收载的银杏叶提取物质量标准中，均规定了黄酮类成分的峰面积比，槲皮素（Q）：山奈酚（K）峰面积比应为0.8～1.2，异鼠李素（I）：槲皮素应大于0.15。多年的研究经验表明，黄酮苷元峰面积比可在一定程度上反映银杏叶提取物的内在质量，为杜绝掺假，规范行业标准，应严格加以控制。本标准参照《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物标准【检查】黄酮苷元峰面积比 项下要求，按〔含量测定〕项下的总黄酮醇苷色谱计算，样品测定结果见下表。
表16& 黄酮苷元峰面积比结果
对照提取物
参考《中国药典》2010年版银杏叶提取物标准，本标准规定，槲皮素与山奈酚的峰面积比应为0.8-1.2，异鼠李素与槲皮素的峰面积比值不小于0.15。
3.4 芦丁限量& 照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VI D）测定
该检测方法完成参照中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 【含量测定】项下总黄酮醇苷的色谱条件进行测定，仅改变了供试品制备方法和流动相比例。
仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（UV检测器）
3.4.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Diamonsil &C18 150×4.6mm 5μm；流动相为A 甲醇-B 0.4％磷酸梯度（38:62）；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为360nm；进样量10μL。理论板数按芦丁峰计算，应不低于2500。
3.4.2 仪器精密度试验
取芦丁对照溶液（浓度0.208mg/mL），重复进样6次，测得芦丁RSD＝1.2％。
3.4.3 标准曲线试验
精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的芦丁对照品适量，加甲醇制成贮备液，然后加甲醇稀释成每1mL中含芦丁为13.0、26.0、52.0、104.0、208.0、416.0μg的溶液，照含量测定项下的方法测定，经线性回归后得回归方程为y = 18.548x + 4.4136，r=0.9999。
&结果表明，芦丁浓度在13.0-416.0μg/mL的浓度范围内呈良好线性关系，标准曲线如下：
3.4.4 供试品溶液制备
取本品细粉约35 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加 70％甲醇溶液适量，使溶解，并稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。
3.4.5 溶液稳定性试验
&&& 取供试品（批号120204）制成的供试液，分别于0、2、4、6、16、24小时，进样10μL，记录色谱图，结果供试品中芦丁峰面积的RSD为1.52 %（n=6），表明本品溶液在24小时内稳定。
3.4.6 重复性试验
取供试品（批号120204），于同一天内称取5份样品测定，芦丁平均含量为2.95%，RSD为0.96％（n=5）。
3.4.7 中间精密度试验
取供试品（批号120204），在不同天内由不同人员取样、并用不同仪器测定5次，芦丁平均含量为2.81%，RSD为1.85％（n=5）。
3.4.8 准确度试验
取供试品（批号120204）约350mg，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备液；精密称取对照品芦丁适量，加甲醇制成0.21mg/mL的对照品贮备液。
精密移取5mL供试品贮备液至9个10mL量瓶，等分为三组，各组分别加入对照品贮备液2mL、2.5mL、3mL，加甲醇稀释至刻度。照含量测定方法测定，计算回收率，结果见下表。
表17 芦丁加样回收率结果
对照品加入量/mg
样品中含量/mg
平均回收率
3.4.9 耐用性试验
本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了初步考察，色谱柱信息及测定结果如下：
色谱柱1：Diamonsil C18 150×4.6mm 5μm；
色谱柱2：Diamonsil C18 250×4.6mm 5μm；
色谱柱3：Agilent Zorbax SB C18 150×4.6mm 5μm；
色谱柱4：Agilent Zorbax XDB C18 150×4.6mm 5μm；
从上图可见，采用上述四种色谱柱均可有效分离芦丁成分，但采用色谱柱2时，芦丁相对保留时间大大延后，为提高检测效率，建议采用C18 150×4.6mm 5μm色谱柱，品牌方面，暂建议采用安捷伦或迪马（一代）公司产品。
3.4.10 结果计算
供试品中芦丁含量以质量分数X2计，数值以%表示，按公式（A3）计算：
………………………………（A3）
X2－供试品中芦丁的质量分数，%；
Ax2－供试品溶液中芦丁的峰面积；
As2－对照品溶液中芦丁的峰面积；
V2―供试品溶液的体积，单位为毫升（mL） ；
c2－对照品溶液中芦丁的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
m2－供试品质量，单位为毫克（mg）。
3.4.11 样品测定
取本品35mg，精密称定，按3.4.4制备供试品溶液。照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录ⅤD）测定，精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取芦丁对照品溶液适量，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
多批银杏叶提取物芦丁含量测定结果见下表。
表18 银杏叶提取物芦丁含量测定结果
浙江康恩贝
浙江康恩贝
浙江康恩贝
中检所对照提取物
市售提取物1
市售提取物2
市售提取物3
结论：上述方法学试验表明，HPLC法测定游离芦丁含量方法可行，订入本标准。
自然界的银杏叶中，游离芦丁含量是有一定范围的，按照《中国药典》标准制备的银杏叶提取物中，游离芦丁含量也不会很高，我公司对不同厂家银杏叶提取物以及中检所提供的银杏叶提取物对照品，测定游离芦丁含量，结果均在2%～3%左右，而从市场采购的部分银杏叶提取物，经检测其游离芦丁含量存在较大差异，见表8。欧洲药典中虽然没有明确控制芦丁含量，但从我公司多年的销售经验看，很多欧盟国家的客户均对银杏叶提取物中芦丁含量进行了限度要求，大部分客户要求芦丁含量为小于3%。
为保证银杏叶提取物质量，防止国内一些不当商业行为扰乱市场秩序，本标准规定，银杏叶提取物中芦丁含量不得高于4.0%。
3.5 游离槲皮素、游离山奈酚和游离异鼠李素限量&& 照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VI D）测定
该检测方法完成参照中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物 【含量测定】项下总黄酮醇苷的色谱条件进行测定，仅改变了供试品制备方法。
仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（UV检测器、DAD检测器）、Agilent 1100系列高效液相色谱仪（DAD检测器）
3.5.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Diamonsil &C18 150×4.6mm 5μm；流动相为A 甲醇-B 0.4％磷酸（50:50）；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为360nm；进样量10μL。理论板数按槲皮素峰计算，应不低于2500。
3.5.2 供试品溶液制备
精密称定银杏叶提取物粉末 35 mg，置10 mL容量瓶中，加 70％甲醇溶液适量，使溶解，并稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。
3.5.3 对照品溶液制备
精密称取槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含30 μg、30 μg、20 μg的混合对照品溶液，即得。
3.5.4检测限和定量限试验
取槲皮素、山奈酚和异鼠李素混合对照溶液，浓度依次为1.18μg/mL、1.30μg/mL、0.8184μg/mL进行限度检测，结果见下表。
表19& 限度检测结果
检测限（ng）
定量限（ng）
3.5.5 专属性试验
取本品35mg，精密称定，按3.5.2制备供试品溶液，照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录ⅤD）HPLC-DAD检测样品中目标成分的纯度，结果见下图。
&&& 从上图可判断，供试品中对应的游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素峰纯度符合要求，说明本测定方法专属性强。
3.5.6 耐用性试验
本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了考察，色谱柱信息及测定结果如下：
色谱柱1：Diamonsil &C18 150×4.6mm 5μm；
色谱柱2：Diamonsil &C18 250×4.6mm 5μm；
色谱柱3：Agilent Zorbax SB C18 150×4.6mm 5μm；
色谱柱4：Agilent Zorbax XDB C18 150×4.6mm 5μm；
从上图可见，采用上述四种色谱柱均可有效分离游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素成分，为提高检测效率，建议采用C18 150×4.6mm 5μm 色谱柱，品牌方面，暂建议采用安捷伦或迪马（一代）公司产品。
3.5.7 结果计算
供试品中游离槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）含量以质量分数X3计，数值以%表示，依次按式（A4）计算：
………………………………（A4）
X3－供试品中游离槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的质量分数，%；
Ax3－供试品溶液中槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的峰面积；
As3－对照品溶液中槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的峰面积；
c3－对照品溶液中槲皮素（或游离山奈酚、或游离异鼠李素）的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
V3―供试品溶液的体积，单位为毫升（mL） ；
m3－供试品质量，单位为毫克（mg）。
3.5.8 样品测定
取本品35mg，精密称定，按3.5.2制备供试品溶液。照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录ⅤD）测定，精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取槲皮素、山奈酚和异鼠李素混合对照品溶液适量，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
多批银杏叶提取物含量测定结果见下表。
表20 银杏叶提取物游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量测定结果
游离槲皮素/%
游离山奈酚/%
游离异鼠李素/%
浙江康恩贝
浙江康恩贝
浙江康恩贝
中检所对照提取物
市售提取物1
市售提取物2
市售提取物3
市售提取物4
市售提取物5
康恩贝作为国内银杏叶提取物的主要生产企业之一，药材来源包括了湖北、山东、江苏等国内国几个主要的大型银杏叶产地。公司多年的检测数据显示，在自然界的银杏叶中，游离槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量是非常低的，提取物中含量也是一样很低，按《中国药典》所载方法制备的银杏叶提取物以及中检所提供的银杏叶提取物对照品，进行含量测定，结果显示游离槲皮素和游离山奈酚的含量均小于0.2%，游离异鼠李素的含量均小于0.1%，而从市场采购的银杏叶提取物，经检测部分提取物中游离槲皮素、游离山奈酚和游离异鼠李素含量异常偏高，见上表含量数据及下图。
从上述对比结果可判断，国内部分银杏叶提取物生产企业在提取物制备过程中可能采取了非常规的行为。为防止国内部分不法商家的掺假、掺杂等行为，保证银杏叶提取物质量，本标准规定，银杏叶提取物中游离槲皮素和游离山奈酚含量均不得高于0.5%，游离异鼠李素含量不得高于0.2%。
3.6 总银杏酸限量&&
银杏叶提取物具有巨大的国际市场，也是我国出口量最大的植物提取物之一。然而，近年来，国内外一些企业生产的银杏叶提取物在外销过程中频频遭遇退货，究其原因大部分都是由于银杏酸的质量检测不符合要求，即使按照《中国药典》2010年版的检测方法控制总银杏酸在5μg/g以下，仍不能满足外销的要求。因此，我们对《欧洲药典》和《美国药典》标准中银杏酸的检测方法进行了深入研究对比。研究发现，三个药典标准中银杏酸的限度检测方法在样品前处理、色谱条件、计算方法及限度要求等方面存在较大差异，对比结果见下表。
表21& 三种药典标准银杏酸限度检测方法对比
USP36-NF31
取GBE 10g，石油醚回流提取，经甲醇溶解
取GBE0.5g，甲醇溶解定容
取GBE0.5g，甲醇溶解定容
流动相：甲醇-1％冰醋酸溶液（90：10）；
检测波长：310nm；色谱柱填料：C18；
进样量：10uL；
对照品：白果新酸C13:0；总银杏酸对照品
流动相：0.01%磷酸乙腈-0.01%磷酸水梯度；
检测波长：210nm；色谱柱填料：C8
进样量：100uL;
对照品：USP银杏酸对照品（ C13:0，C15:1和C17:1）
流动相：0.01%三氟乙酸乙腈-0.01%三氟乙酸水梯度；
检测波长：210nm；
色谱柱填料：C8；
进样量：50uL;
对照品：EDQM银杏酸对照品，C17:1含量为0.35%
以 白果新酸C13:0为对照，以总银杏酸对照品相应5个色谱峰峰面积总和计总酸
分别计算银杏酸C13:0，C15:1和C17:1含量,相加得总银杏酸含量。
以银杏酸 C17:1为对照，以C13:0，C15:1和C17:1三个色谱峰面积总和计总酸。
值得注意的是，在前处理方法方面，中国药典采用石油醚回流提取，浓缩后甲醇转移定容的方法，美国药典与欧洲药典均采用提取物甲醇溶解，直接定容的方法。本研究对不同前处理方法进行了比较，6批供试品同时按照Ch.P和EP标准进行前处理，然后按照Ch.P标准测定和计算，结果见下表。
表22 不同前处理方法测定结果对比
总银杏酸/(μg/g)
从上表对比结果显示，按Ch.P标准前处理测定结果显著低于按EP标准前处理测定结果。研究认为，EP和USP标准采用提取物甲醇直接溶解、定容，操作简便，银杏酸几乎零损失，而中国药典标准采用石油醚回流提取银杏酸，操作步骤较复杂，且提取溶剂石油醚极性较小，溶剂量较少，提取过程中，提取物极容易被包裹起来，从而导致银杏酸提取不完全，测定结果远低于EP标准的测定结果。因此，EP标准的前处理方法较Ch.P标准更准确、便捷，更能反映银杏叶提取物中总银杏酸的真实情况。在此基础上，本标准参照EP和Ch.P标准，总银杏酸限度检测方法中，参照了EP的前处理方法来制备供试品，色谱条件和计算方法仍参照Ch.P标准，对总银杏酸限度检测方法进行了修改，验证结果如下。
照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VI D）测定
仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪（UV检测器）、Agilent 1100系列高效液相色谱仪（DAD检测器）
3.6.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Agilent Zorbax XDB C18 150×4.6mm 5μm；流动相A 甲醇-流动相B 1%冰醋酸溶液(90:10)；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为310nm；进样量10-50μL。理论板数按白果新酸峰计算，应不低于4000。
3.6.2 供试品溶液制备
取本品 0.5-1.0 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇8 mL溶解，若有必要，可用超声波处理，并用同样的溶剂稀释至10 mL。用 0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
3.6.3 对照品溶液制备
白果新酸对照品：精密称取白果新酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 μg的溶液，摇匀，即得；
定位用对照溶液的制备：取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，摇匀，即得。
3.6.4检测限和定量限试验
取白果新酸对照溶液，浓度为4.9μg/mL进行限度检测，结果见下表。
表23& 限度检测结果
检测限（ng）
定量限（ng）
3.6.5 专属性试验
取本品0.5-1.0g，精密称定，按3.6.2制备供试品溶液，照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录ⅤD）HPLC-DAD检测样品中目标成分的纯度，结果见下图。
从上图可判断，供试品中对应的银杏酸三个主要峰C13:0、C15:1和C17:1的峰纯度符合要求，说明本测定方法专属性强。
3.6.6 耐用性试验
本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了初步考察，色谱柱信息及测定结果如下图：
色谱柱1：Diamonsil C18 250*4.6mm 5μm；
色谱柱2：Phenomenex C18 250*4.6mm 5μm；
色谱柱3：Agilent XDB C18 250*4.6mm 5μm；
色谱柱4：Kromasil 100-5- C18 250*4.6mm；
色谱柱5：Agilent XDB C18 150*4.6mm 5μm；
&&& 从上图可见，采用上述四个厂家五种色谱柱均可有效分离银杏酸成分，为提高检测效率，建议采用C18 150×4.6mm 5μm 色谱柱，品牌方面，建议安捷伦（Agilent）；菲罗门（Phenomenon）；。
3.6.7 结果计算
供试品中总银杏酸的含量以X4(以白果新酸计）表示，按式（A5）计算。式中供试品溶液中总银杏酸的峰面积为C13:0（白果新酸）、C15:1、C17:2、C15:0、C17:1 5种组分峰面积之和。
………………………………（A5）
X4－供试品中总银杏酸含量，单位为毫克每公斤（mg/kg）；
Ax4－供试品溶液中各银杏酸组分峰面积之和；
As4－对照品溶液中白果新酸（C13:0）的峰面积；
c4－对照品溶液中白果新酸 （C13:0）的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V4―供试品溶液的体积，单位为毫升（mL）；
m4－供试品质量，单位为克（g）。
3.6.8 样品测定
取本品0.5-1.0g，精密称定，按3.6.2和3.6.3制备供试品和对照品溶液，精密吸取供试品溶液50 μL、对照品溶液及定位用对照溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量。
多批银杏叶提取物含量测定结果见下表。
表24 银杏叶提取物总银杏酸含量测定结果
总银杏酸/（mg/kg）
浙江康恩贝
浙江康恩贝
浙江康恩贝
市售提取物1
市售提取物2
市售提取物3
国内外大量文献报道显示，银杏酸具有细胞毒性、胚胎毒性、致敏性及致突变作用，被广泛认为是银杏叶提取物及其制剂中的毒性物质，WHO及多国药典（包括现行版EP和USP）要求银杏提取物中总银杏酸的含量不得大于5mg/kg，现行《中国药典》2010年版要求银杏叶提取物中银杏酸限度小于10mg/kg，显然已经落后于国际标准。为使本标准能够真正做到与国际标准接轨，参考EP7.0和USP36药典银杏叶提取物标准中银杏酸限度的要求，本标准规定，银杏叶提取物中总银杏酸限度为≤5.0mg/kg。
按中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX H 水分测定法第一法进行测定，结果见下表。
表25& 水分测定结果
本标准规定，本品水分不得过5.0 %。
3.8 炽灼残渣
参照《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物标准【检查】炽灼残渣 项下要求( 药典附录IX J），测定样品，结果见下表。
表26& 炽灼残渣测定结果
炽灼残渣（%）
参考《中国药典》2010年版银杏叶提取物标准，本标准规定，本品炽灼残渣不得过0.8 %。
3.9 重金属
参照中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX E 重金属检查法的方法和中华人民共和国药典（2010年版）一部附录IX B 铅、镉、砷、汞、铜测定法，测定样品中重金属和铅、镉、砷、汞，结果见下表。
表27& 重金属测定结果
重金属（mg/kg）
铅（mg/kg）
镉（mg/kg）
砷（mg/kg）
汞（mg/kg）
参考《中国药典》2010年版银杏叶提取物标准，本标准规定，本品重金属（以Pb计）不得过10 mg/kg，铅不得过1.0 mg/kg，镉不得过0.3mg/kg，砷不得过1.0 mg/kg，汞不得过0.1 mg/kg。
3.10 微生物要求
参照《中国药典》2010年版一部中附录XⅢ C规定的方法检查细菌、霉菌、酵母菌数，及大肠杆菌，结果见下表。
表28& 微生物检查结果
细菌总数/（cfu/g）
霉菌及酵母菌数/（cfu/g）
&& 三批样本细菌总数、霉菌及酵母菌总数均小于10 cfu/g，参考中国药典标准，本标准规定，本品细菌总数不得过1000cfu/g，霉菌及酵母菌总数不得过100 cfu/g，大肠杆菌不得检出。
4 参考文献
[1]&&&&& GB/T1.1-2000 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则
[2]&&&&& GB/T1 标准化工作指南& 第2部分：采用国际标准的规则
[3]&&&&& GB/T1 标准编写规则 第4部分：化学分析方法
[4]&&&&& GB 9685 食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准
[5]&&&&& 中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物（鉴别），北京：中国医药科技出版社
[6]&&&&& 中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物（含量测定）：总黄酮醇苷，北京：中国医药科技出版社
[7]&&&&& 中华人民共和国药典（2010版）一部银杏叶提取物（检查）：黄酮苷元峰面积比，北京：中国医药科技出版社
[8]&&&&& 中华人民共和国药典（2010版）一部附录IX B 铅、镉、砷、汞、铜测定法，北京：中国医药科技出版社
[9]&&&&& 中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX E 重金属检查法，北京：中国医药科技出版社
[10]& 中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX J 炽灼残渣检查法，北京：中国医药科技出版社
[11]& 中华人民共和国药典（2010版）二部附录Ⅺ B 粒度测定法第二法，北京：中国医药科技出版社
[12]& 中华人民共和国药典（2010版）一部附录 XIII C 微生物限度检查法，北京：中国医药科技出版社
[13]& 中华人民共和国药典（2010版）一部附录 IX H 水分测定法第一法，北京：中国医药科技出版社
[14]& 欧洲药典（EP7.0）银杏叶提取物，欧洲药品质量管理局颁布
[15]& 美国药典（USP32/NF27）银杏叶提取物，美国药典委员会