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酶活力的测定
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几种常见饲用酶制剂的酶活测定与分析
&&几种常见饲用酶制剂的酶活测定与分析
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酒精专用酶技术
时间： 14:02:00 来源：百度文库
酒精专用酶技术
酒精生产的主要原料：1、 &甘薯：俗称地瓜、红薯
甘薯作为酒精生产的原料具有以下优点： 1 单位亩产量高； 2 淀粉含量高；缺点是： 1 含纤维量大； 2 胶体，果胶质等粘性物质含量高，醪液粘度大；
甘薯的主要化学成分：
1） &淀粉：淀粉是甘薯的主要贮藏物，含量大约为干物质量的68%左右，其淀粉颗粒常以2－6粒结合在一起，形成特殊的团粒状态。
2） &蛋白质：甘薯中约含2－5%的蛋白质，其中三分之二是纯蛋白，三分之一是酰胺类化合物。
3） &纤维素及半纤维素类：甘薯中含有一定量的纤维类物质，纤维素是葡萄糖苷以β－1.4葡萄糖苷键结合而成的多糖聚合体，性质非常稳定，不宜水解。它在甘薯中含量不大，但由于其与淀粉，蛋白质等大分子以交织状态存在而固定淀粉等大分子的作用却很大。
4） &其它：甘薯中除含上述物质外，还含有少量的单糖，双糖及树胶物质等。
2、 &玉米：俗称苞米
玉米是酒精生产的另一大类原料，它具有同甘薯相似的原料优点。
玉米的化学成分：
1） &淀粉：是玉米的主要贮藏物。不同玉米品种含有不同量的支链淀粉和直链淀粉，它们大部分存在于玉米的胚乳中，含量约为玉米重量的65－72%左右。
2） &蛋白质：玉米中约含有9%左右。
3） &脂肪：在胚芽中，因不利于发酵而被除去。
4） &纤维素及半纤维素：玉米中纤维素及半纤维素约占4－6%，生产中，这些物质不易水解且夹杂挟裹了一定数量的工艺可利用物质，造成了原料出酒率的损失。
3、 &原料的植物特点与原料出酒率。
酒精生产中，原料出酒率的提高是永久的主题。随着生物技术及化学工程的发展，出现了诸多的新工艺来降低工艺损失，提高原料出酒率。如耐高温α－淀粉酶与喷射液化技术的结合使原料的予处理得率提高，高活力商品糖化酶的应用取代了繁杂的液体制曲工艺，同样提高了原料出酒率。
但是，淀粉质原料由于其本身的特点，仍影响了原料出酒率的进一步提高。如前所述，原料中均含有纤维素及半纤维素物质。纤维素性质稳定，极难水解。半纤维素的结构与纤维素不同，是由一大类不同结构的多聚糖结合而成，较易水解。纤维素与半纤维素相互交缠扭合，组成不易被破坏的网状细胞壁结构，网状结构中包挟了部分淀粉、蛋白质等大分子工艺可利用物质，这些物质在工艺中无法被释放、利用而造成原料的损失。
原料中尚含有一定量的果胶质和少量β－葡聚糖类粘性物质。它们以不稳定的果胶状态存在于醪液中使之粘度增大，同时它们也粘附在工艺有效物质的外表而阻碍了其它酶类与工艺有效物质的接触，使得糖化发酵过程速度减缓，也不利于原料出酒率的提高。
因此，这些问题的解决将使酒精的原料出酒率进一步提高，这就引发了酒精专用复合酶制剂的解决方案：
二、酒精专用复合酶制剂的解决方案：
酶的作用对于酒精的生产非常重要。解决上述问题，进一步提高原料出酒率的专用复合酶制剂应包含以下的内容：
1、 &足够的纤维素酶及半纤维素酶：纤维素酶的作用是水解原料中的纤维素，破坏其链状结构及其与半纤维素构合的网状细胞壁结构，释放出其中被挟裹的淀粉及蛋白质等工艺有效物质而提高原料出酒率。半纤维素酶协同纤维素酶水解纤维素及半纤维素为微生物可利用的物质，进一步提高原料出酒率
2、 &适量的果胶酶及β－葡聚糖酶：果胶酶及β－葡聚糖酶的作用解除了果胶、β－葡聚糖等粘性物质的阻碍，增强其它酶类与工艺有效的接触效果，从而提高酶反应速率，起到协同作用。同时可降低醪液粘度减小输送动力消耗。
我公司研制开发的酒精专用复合酶是具备以上各酶系的复合酶制剂，在酒精生产中使用的作用是：
1：）水解原料中的纤维素及半纤维素，破解细胞壁，充分释放工艺有效物，提高原料出酒率。2：）降低醪液粘度，减小流体输送中的动力消耗。
3：）增加发酵中酵母可同化氮源的量，促进发酵旺盛进行。
三、酒精专用复合酶的特点：
我公司的酒精专用复合酶是用高效产酶菌经液体深层发酵，超滤浓缩提取精制，喷雾干燥而制成的白色或微黄色粉末状制剂。该制剂含有纤维素酶、半纤维素酶、β－葡聚糖酶、果胶酶等多种作用于植物细胞壁的水解酶，其中：
1）纤维素酶所含的主要酶组份为：CMC酶：羧甲基纤维素酶（EC.3.2.1.4）,分为纤维素内切酶和纤维素外切酶，内切酶作用于纤维素大分子，在大分子间随机切开β－1.4键，将聚合度很高的纤维素分子水解成低聚合度的纤维寡糖；外切酶作用于纤维素分子的非还原性末端，依次切下葡萄糖单体，产物为葡萄糖。该酶的专一性很强，它对经内切酶作用后的纤维寡糖有很强的亲合力。
C1酶：微晶纤维素酶（EC、3、2、1、91），该酶分内切、外切酶系 ，作用于纤维素的产物分别是纤维寡糖，纤维素二糖和葡萄糖。
Cb酶：葡萄糖苷酶（EC.3.2.1.21），它能水解纤维素寡糖及纤维二糖为葡萄糖。
2）半纤维素酶包含的酶组份为：
本聚糖酶（EC.3.2.1.51），其内切外切酶系可将戊聚糖分解为五碳糖等。
3)果胶酶包含的酶组分为：
果胶质解聚酶：
对果胶作用的解聚酶分为a：聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG），有内切、外切两种酶系（EC.3.2.1.41）；
b：聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（PMGL），分内切、外切两种酶系（EC.4.2.2.3），果胶酸解聚酶：a：聚半乳糖醛酸酶（PG），分内切（EC.3.2.1.15），和外切（EC.3.2.1.40）两个酶系；b：聚半乳糖醛酸浆解酶（PGL），分内切（EC.4.2.2.1）和外切（EC.4.2.2.2）两个酶系；
果胶酯酶（PE）、（EC.3.2.1.1.11）
5)β－匍聚糖酶包含的主要酶组份为：内、外切β－匍聚糖酶和β－匍聚糖苷酶等
本制剂在生产时，发酵培养基中加入诱导性底物，诱导生产针对酒精酿造的专用酶系组份。
酶活为：β－匍聚糖酶 & & & & & &45万u/g
纤维素酶 & & & & & &11万u/g
半纤维素酶 & & & & & & 8万u/g
果胶酶 & & & & & & & & 8万u/g
由于制剂中酶活组份复杂，在实际使用中无法制定一个对所有酶活都正好适宜的酶活曲线，本公司根据酒精工艺的实验模拟测试，测得其最佳工艺效果表现的PH曲线为：
四、酒精专用酶制剂的使用、贮存及失活：
使用时，先用适量（W/W：水/制剂≈4/1）的30－40℃的工艺用水将本制剂搅拌，约5分钟后投入糖化锅中即可。在溶液中可能会有些许不溶物，这些不溶物是酶活保护剂，不影响糖化工艺及使用效果。制剂溶液投入糖化锅后，其它工艺操作按原定工艺进行。对于不同的原料，本公司推荐的加量为原料干重的0.03－0.06%。工业化使用前，请根据所采用的原料及工艺进行实验室小试以确定最佳用量。
本产品是经过修饰保护的稳定的粉末状酶制剂。原包装在15－35℃无阳光照射、干燥的环境下10个月酶活损失率小于5%，原包装开封或制成液体后，不能长时间保存。5－15℃低温贮存18个月酶活损失率低于5% 3)失活：本产品在下列情况下永久失活或很快失活：
a：PH&2.5或PH&7.0
b：温度大于68℃或低于0℃
五、本酶制剂的酶活检测：
1、）纤维素CMC酶
用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。
生产分析和质量控制部门适用。
纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖生产的量,从而确定出酶的活力单位。
4.1无水醋酸钠(分析纯)
4.2冰醋酸(分析纯)
4.3 3.5－二硝基水杨酸
4.4无水葡萄糖
4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)
4.6氢氧化钠(分析纯)
4.7重蒸苯酚(分析纯)
4.8无水亚硫酸钠(分析纯)
4.9叠氮化钠(分析纯)
4.10羧甲基纤维素钠
5.1水浴锅(恒温)501℃
5.2电热干燥箱801℃
5.3 722型分光光度机计
5.4分析天平感量0.1㎎
5.5一级玻璃制品
6．0试剂的准备
6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸能，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
6.2 DNS试剂:
溶液A:称分析纯NaoH104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
将A、B溶液混合，加入1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。
7．0标准曲线制作：
7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。
7.2准称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
7.3标准葡萄糖曲线制作
取1mg/ml标准葡萄糖液各0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS试剂,具塞,沸水浴中加10分钟,冷却后定容止15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相似合Y=ax+b一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。
8.0 CMC酶活性测定。
8.1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。
8.2分析程序：
取三支15ml刻度试管分别加入0.ml2稀释酶液，在分别吸取1.8mlCMC溶液,50℃水浴保温30分钟,空白样用0.2ml稀释酶液,加入1.8ml醋酸缓冲液,同样50℃水浴30分钟,再吸取DNS2ml要匀后,具塞,沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀,用空白调零点,于550nm下测OD值。
9.0计算活力单位
A×D×5×1000
CMC酶活力=————————μ/g(ml)
A：OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（）
D：酶粉（液）稀释倍数
2、）半纤维素酶：
用3.5一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位
生产分析和质量控制部门适用
半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3.5一二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过栽550nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。
4.0单位定义
一个半纤维素酶单位定义为；1g酶粉（或1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生一微克还原糖（以木棉糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。
5.1无水醋酸钠（分析纯）
5.2冰醋酸钠（分析纯）
5.3 3.5一二硝基水杨酸（分析纯）
5.4木糖（分析纯）
5.5四水酒石酸钾钠（分析纯）
5.6氢氧化钠（分析纯）
5.7重蒸本酚（分析纯）
5.8无水亚硫酸钠（分析纯）
5.9叠氮化钠（分析纯）
5.10木聚糖（分析纯）
6.1水浴锅（恒温）50℃
6.2电热干燥箱80℃
6.3 772型分光光度计
6.4分析天平感量0.1
6.5一级玻璃制品
7.0试剂的制备：
7.1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml配成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2gNaAC，溶解后容至1000ml，制成0.1MNaAC溶液。
使用溶液以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
7.2 DNS试剂
溶液A：称分析纯NaoH104g，溶于1300ml水中，加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。B：称分析纯酒石酸钾钠910g溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钾钠加入酒石酸钾钠溶液，将A、B溶液混合加入1200ml中，储存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
7.3木聚糖溶液：用木聚糖以PH4.8醋酸缓冲液配成1%溶液。
8.0标准曲线制作：
8.1木糖80℃烘干至恒重。
8.2标准称取1.000g木糖以溶于1000ml水中，加10ml叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
8.3标准木糖曲线制作
取1mg/ml标准木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2补加水至2.0ml，加入2.0mlDNS试剂,具塞、沸水浴中加热10分钟，冷却后定容至15ml，分光光度计550nm波长下测OD值，3次重复试验的均值用最小二乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程，由光密度值引得木糖量。
9.0半纤维素酶活性测定；
15ml刻度试管中加入稀释酶液0.2ml（三支平行样），再各吸取1.8ml1%的木聚糖溶液，摇匀，50℃水溶60分钟，取出后，再吸取2mlDNS试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10分钟，冷却后，补加水加定容到15ml，轻轻上下摇匀，空白用0.2ml稀释酶液家。1.8ml醋酸缓冲液，不加木聚糖溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于550nm下测OD值。
10.0计算活力单位:
半纤维素酶活力=(A×D×5×1000)÷60 & u/g(ml)
A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)
D:酶粉(液)稀释倍数
3、）果胶酶
用次碘酸钠法测定果胶酶活力单位
生产分析和质量控制部门适用。
果胶酶水解果胶生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力。
4.0单位定义:℃
1g(或1ml液体酶)酶粉,于500CPH3.5条件下,每分钟催化果胶水解生成1微克半乳糖醛酸的酶量为一个活力单位，以u/g(或u/ml)表示。
5.0试剂和溶液：
5.1 1%果胶溶液：
称取分析纯果胶1g，用热水溶解煮沸，冷却后过滤，调PH至3.5，定至100ml。
5.2 0.1N碘液：
5.3 0.05N硫代硫酸钠
5.4 0.5%可溶性淀粉指示剂
5.5 1M碳酸钠溶液
6.0 &分析步骤
先称取1—2g酶粉，加入100ml水，于50℃水浴浸取1小时，过滤，滤液为供试酶。
取1%果胶酶10ml加入和5ml酶液和5ml蒸馏水（调（PH3.5），在50℃水浴中保温反应一小取出加热煮沸，冷却后，补水至20ml，取5ml反应液于100ml碘量瓶中，加1M碳酸钠溶液1ml，0.1N碘液5ml，摇匀，具塞，于室温暗处下放置20min，加N硫酸2ml，立即佣0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加1ml10.5%可溶性淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失为止，空白试验以煮沸失活的酶液或蒸馏水代替酶液进行滴定。
（B－A）×N×0.5×175×20×n×1000
X=—————————————————————————
5×5×W×60
式中：X：样品的酶活力，（u/g或u/ml）
A：样品滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。
B：空白滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。
N：硫代硫酸钠当量浓度。
0.5：1克当量硫代硫酸钠相当于0.5克当量半乳糖醛酸。
20：反应液总体积
5：酶液体积以1ml计
5：吸取反应液
n：稀释倍数 &
W：酶粉重量g或酶液体积ml
4、）β—葡聚糖酶
用3.5一二硝基水杨酸法测定β—葡聚糖酶活性单位。
生产分析和质量控制部门适用。
β—葡聚糖酶（EC.3.2.1.6）水解内切1，3（4）－β－D－葡聚糖苷键。释放出的还原性双糖基因与3，5二硝基水杨酸（DNS）发生反应，产生颜色变化，这种变化与释放的还原性双糖的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在540nm的光吸收值查对标准曲线（以麦芽糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定酶的活力单位。
4.0单位定义
一个β—葡聚糖酶单位定义为：1g酶粉（或1ml酶液）于50℃PH5.0条件下每分钟水解1%β—葡聚糖溶液产生一微克麦芽糖的酶量定义为一个β—葡聚糖活力单位。
5.1无水醋酸钠（分析纯）
5.2冰醋酸（分析纯）
5.3大麦β—葡聚糖（Megazyme公司产品粘度：24cSt）（分析纯）
5.4 &3．5一二硝基水杨酸（分析纯）
5.5单水麦芽糖（分析纯）
5.6四水酒石酸钾钠（分析纯）
5.7氢氧化钠（分析纯）
5.8苯甲酸（分析纯）
5.9无水乙醇（分析纯）
6.1水浴器50℃1℃
6.3可见光范围分光光度计（540nm）波长
6.4沸水水浴器
6.5一级玻璃制品
6.6振荡混合器
6.7系列自动取样器
7.0试剂的准备
7.1 &1M醋酸钠
溶解8.2克醋酸钠在大约80ml无离子水中，待彻底溶解，用无离子水定容至100ml。
7.2 &1M冰醋酸
小心量取5.7ml冰醋酸加入大约80ml无离子水中，用无离子水定容到100ml。醋酸有腐蚀性，操作必须防护镜和手套。
7.3 &1M醋酸缓冲液（PH5.0）
用1M醋酸将100ml1M醋酸钠的PH调至5.0 & 0.05室温贮存，用PH。
7．4 &1%β—葡聚糖底物缓冲液
准确称取0。25gβ—葡聚糖进入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子在沸水中煮5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流水降温。将已冷却到室温的底物溶液倾入一只25ml容量瓶中，加入2.5ml1M醋酸缓冲液（PH5.0），并用无离子水定容到25ml。
7．5 &3，5二硝基水杨酸溶液
称取30g四水九石酸钾钠放入500ml锥形瓶内，加16gNaOH，加50ml无离子水，缓慢加热溶解，溶液变清澈后逐渐加入1g3，5二硝基水杨酸，直至彻底溶解，冷却到室温，用无离子水定容至100ml。避光，避CO2保存，操作中戴手套。
7．6 &0.1%苯甲酸
0.1苯甲酸加入大约80ml无离子水中溶解，用无离子水定容至100ml。
8.0标准曲线制作
测定用溶液的稀释按下表配置
麦芽糖含量 （mg/ml） & &麦芽糖原液 (ml) & & 无离子水 (ml)
0．2 & & & & & & & & & 0．2 & & & & & & & & & &9．8
0．4 & & & & & & & & & &0．4 & & & & & & & & & &9．6
0．6 & & & & & & & & & 0．6 & & & & & & & & & &9．4
0．8 & & & & & & & & & 0．8 & & & & & & & & & 9．2 &
8．1麦芽糖用前须于105℃干燥恒重
8．2称1g麦芽糖（恒重）溶于80ml10.1%苯甲酸溶液中，彻底溶解后，转移到100ml容量瓶中，用0.1%苯甲酸溶液定至100ml，配好的溶液可以在4℃保存三个月。
8．3标准曲线每两个月必须重新制作，每次制作标准曲线必须做5个标准点。
8．4准备一系列干净试管，每个稀释浓度做三个平行。去测定稀释液1.0，加1.0无离子水。空白为2ml无离子水，50℃保温10分钟。
8．5保温10分钟后，加10mlDNS溶液，具塞、沸水煮5分钟。
8．6水浴冷却，加10ml无离子水，混合均匀。
8．7于540nm比色，读OD，用空白调零点。
8．8以浓度对光密度（OD）作图。 &
9.0分析程序
9.1对于每一个被测酶样品，取1ml底物溶液置于四支试管(1ml/管),三支供测试酶活性，一支作空白,50℃1.0℃保温2-3分钟.
9.2加1ml酶稀释液向三个试管中，空白管中加1ml无离子水代替酶稀释液。
9.3四支试管均于50℃反应10分钟。
9.4加2mlDNS试剂,具塞,沸水煮5分钟。
9.5冰浴冷却后，加10ml无离子水，充分混匀。
9 6于540nm测OD，用空白管调零。
10．0计算活力单位
10.1麦芽糖产生的毫克数，可以通过标准曲线查出。
10.2β—葡聚糖酶活力单位 &
, & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &麦芽糖（）×D×F×1000
β—葡聚糖酶活力单位=————————————————
10=反应时间
W=酶样品重量（g）
F=底物校正因子（1.047）通常由底物提供厂家标明
D=酶稀释倍数
六、本制剂的使用安全性及所依据的标准。
1、 &安全性
商品名：酒精专用复合酶制剂JJ
酶种类：复合酶
使用危险性：无。不含对人体及食品有危害的物品。
外观：白色至微黄色粉末
气味：无味或微弱发酵微
包装：500-1000g袋
b：注意事项
本品属于不易燃烧物品，对人体无刺激无伤害，如遇以外不慎将本品混入眼睛中时，请立即用清水冲洗。
2、 &适用标准
a：卫生指标：
符合中华人民共和国行业标准QB对食用酶制剂的卫生要求。
检测方法符合下述标准：
重金属：中华人民共和国标准《食品添加剂中重金属限量试验法GB8451-87》
大肠菌群：中华人民共和国标准《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB》
细菌总数：中华人民共和国标准《食品卫生微生物学检验菌落总数测定GB》
霉菌：中华人民共和国标准《食品卫生微生物学检验霉和酵母计数GB》
沙门氏菌：中华人民共和国标准《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB》
b：酶活检验
中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通试验方法QB/T1308-93》
中华人民共和国行业标准《工业酶制剂通用检验规则和标志、包装、运输、贮存QB/T180493》
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实验二淀粉酶活性的测定
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