流式立式轴流泵型号及参数求助

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-02-26 06:44 标签： 立式轴流泵型号及参数
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求助流式细胞术分析细胞周期(PI染色)，关于流式细胞仪的操作（BD FACSAria II）
我现在做了某肿瘤细胞的稳转细胞系，想通过流式细胞仪分析稳转细胞系和对照组细胞系的细胞周期变化，
前期处理细胞：乙醇固定，PI染色（RNase A），然后上流式，用的机器是BD FACSAria II,
但是关于操作流式细胞仪分析细胞周期没有做过（之前只是用来筛选稳转单克隆细胞），请问大家
有没有关于操作流式来分析细胞周期的资料或者 麻烦大家简单描述一下关于流式分析细胞周期的流程~
在此不胜感激！！！
错字好多。。。“要留一些细胞” “细胞大小”
1、关于细胞的固定于染色：你提到先用RNase A降解RNA，然后加PI染色。如果将这两步合到一起可以吗？就是配一个染液，含有RNase A。
2、关于流式细胞仪的操作中，filter是依据什么进行选择呢？
3、您提到“对单细胞群进行单色检测PI，用Histogram图，对照细胞调节参数”，这一步对照细胞（PI未染色）对吧？
非常感谢您的解答，我实验的目的也就是想得到G0/G1、S、G2/M这三个时期细胞所占的比例。之前用流式分选过稳转细胞系（荧光蛋白）。
1. 可以的。一般是先加RNaseA然后直接再加PI，中间没有等待时间，所以和你所说的配一个含有RNase的染液是没什么差别的。其实反正都是要加两次东西，没必要先配，直接加一个再加一个就好了。
2. filter的选择是根据染色剂的激发态（excitation）和发射光谱（emission）。
-第一个回答的时候，貌似写错了。。。我本来是想说PI的excitation-emission是535-617，也就是说PI是被535nm左右激光激发，然后再617nm左右发射。光谱不太了解的话可以上网查到。
-BD FACSAria II的laser和filter具体参数我不太了解，BD LSRFortessa的话可以用561-610/20，前面是激光后面是Filter。其中选561nm是因为这个是Fortessa里最接近PI激发态波长的激光了；而610/20的意思是可以接受610nm上下摆动20nm的光，也就是590-630nm，PI的emission=617正好落在这个区间内。具体你的AriaII上如何选，要看机器配备的laser和filter是什么。
3. 是的，是未染色的细胞。刚开始调参数的时候都用未染色的对照组细胞，不用浪费染色的样本。参数调好之后，就不要再改变，然后再上样本细胞（染色）。这一步很多人都略去不做，其实的确不是必需的，毕竟在这里你不需要未染色细胞来确定Gate。只不过在你用Histogram图的时候，有时因为电压设定的问题，可能你的峰图偏到了图表的左侧或者右侧。我一般习惯用未染色的细胞先调整，然后再上样本。
4. 有一点忘了说了，在你做Histogram图的时候，由于你是在测量DNA含量，所以y轴坐标一定要用线性而不要用指数。
最后送一张细胞周期分析的图（网上偷来的哈哈）：
左边是纯靠目测来确定的Gate，右边是用一些流式软件自带的算法通过使各个部分符合正态分布而确定Gate，你可以看出来还是差别不小的。。。不过只要你用一种方法坚持到底，应该就没什么问题。
同时，你也可以看到这里y坐标是线性的。
以上是暂时能想到的，希望有帮助。有什么问题可以再我问就好啦。
QQ截图21.png
不知道为什么左边那半张图传了两次。。。忽略吧
哇、感觉你像大神，能加个QQ吗？
我今天处理细胞，明天上流式分析，到时候碰到问题可以问你吗现场？:hand::hand:
哈哈。。我不是什么大神，只是平时会用到流式罢了。流式的很多东西我自己都还没搞懂呢
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我采用AnnexinV-PI双染测定细胞凋亡，是这样的，不知道行不行？下面的图是对照组的。
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设门后，看分布，右上是死细胞A-P+，右下是凋亡细胞A+P-，左下是活细胞A+P-
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凋亡细胞用Annexin V和PI染色以后的分区，需要根据对照管来设置。不知道你的实验中有没有实验前的活细胞，如果有的话，就用活细胞染色，然后设置十字门，用画的十字线压住活细胞群的边缘，这样对比以后，哪些细胞发生了凋亡就一目了然。如果没有活细胞群，你可以就实验的细胞做两个单染色的管，一个单染PI，来确定竖线位置，一个单染Annexin V来确定横线位置。如果不设置对照管的话，你分区的时候，十字线左右动一动都会偏差很大。我看了你的图，十字线在X轴上都画到了10的2次方的位置，有点太偏右了。
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这个图最大的错误就是FL2的电压不够，会影响到你的实验数据，rmjy1981 说得10的2次方的位置，有点太偏右了，是的，为了图的美观，就你这幅图而言，FL2的电压应该加大，FL1减小，当然如果只是单纯的十字线靠右，因为要根据细胞分群而划线，你的数据是不会有影响的
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请问根据我现在的这个图，得出的凋亡比例数据是否可靠呢？
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请问根据我现在的这个图，得出的凋亡比例数据是否可靠呢？
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你没搞明白啊～就你这一幅图根本没法得出你凋亡的结论。给你个图看看吧，上面一个是活细胞对照，下面一个是染色后的凋亡/坏死。
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回复 #6 kuaizige 的帖子
那怎样才能从我的图上得到凋亡数据呢？请告诉我。是不是移动十字线啊？
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请问各位行家，如何设置活细胞区在十字象限中的位置。从我的图上看，图像的下部应该有很多还没有显示出来，所以应该怎样将图像往上移动呢？
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请问各位：根据上面提供的流式图，是不是如果我将FL2的电压加大，FL1的电压减小，就会使得到的图像往上移动，并且同时往左边移动呢？
另外，为什么我的图像中，细胞分区聚集的现象不明显呢？好像正常的，凋亡的，死亡的细胞分界十分模糊，这应该怎么解决呢？
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电压不是随便加减的,十字架也不能随便移动.
电压和项限位置是根据对照来调节的,每次上机检测都要做4个对照,一个是空白细胞,不加FITC和PI,一个是单染FITC,一个是单染PI,然后再一个是要双染的,这样能便于调节参数和画门.君，已阅读到文档的结尾了呢~~
全自动流式细胞分析系统参数
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