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测定酶活力时，为什么要控制酶的稀释倍数
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若测定酶活力时，希望测出反应时间和反应产物生成量的关系，需要什么样的具体实验操作？求大神！
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何以1992 发表于
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测酶活力，要求底物远远大于酶量。控制酶稀释倍数，因该是这个目的。
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伊甸渊 发表于
测酶活力，要求底物远远大于酶量。控制酶稀释倍数，因该是这个目的。
怎么操作哩
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何以1992 发表于
怎么操作哩
睡个午觉先⊙▽⊙醒了给你找找看
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伊甸渊 发表于
睡个午觉先⊙▽⊙醒了给你找找看
谢谢哈，表忘了哈，我考研试卷上滴，不会做
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何以1992 发表于
谢谢哈，表忘了哈，我考研试卷上滴，不会做
终止反应法：是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。
连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。
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都是网上找的。我只是有影响见过。但题不见了。至于具体的实验步骤。真的爱莫能助呀O_o上学期生化实验也没好好做
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看了一下。百度文库里有一些介绍。你可以看看
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1.75亿学生的选择
酶活力测定的注意事项有哪些?
1．底物浓度 除选择适合的底物外,在实际应用中更多考虑的是底物浓度.由于[S]与反应速度V成双曲线关系,在酶活性测定时,要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比.[S]范围一般选择在10～20Km为宜,此时反应速度基本达到最大反应速度,测定的误差在可接受范围.2．酶浓度 在反应条件一定时,酶浓度与反应速度成正比.按照中间产物学说,只有[S]>>[E]时,酶才能被底物分子饱和,反应速度才能达到最大值.因此当标本酶活力过高时,应将标本适当稀释后再加以测定.3．温度 不同的酶最适温度可以不同,多数酶的最适温度在37～40℃,高于或低于最适温度,酶活性都降低.目前,酶活性的测定温度尚未统一,但常规实验室多使用37℃.温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数(Q10)表示.温度系数指温度每升高10℃,化学反应速度增加的倍数.Q10通常为l～2.由温度系数得知,温度的变化对酶活性有着重要影响,因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行,温度波动要控制在±1℃.4．离子强度和pH值 在最适pH时,酶的活性最强,高于或低于最适pH,酶的活性都降低,多数酶的最适pH在5～8之间.在测定酶活性时,要求缓冲液具有足够的缓冲容量,以便使pH值保持稳定.血浆或血清标本含有多种缓冲溶质,具有较强的缓冲能力.为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响,使pH不致偏离设定值,标本用量不宜过大,血浆或血清标本体积／反应液体积≤1／10为宜.5 辅助因子 某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子,例如Zn2+是羧基肽酶的辅基,Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基,NADH是不需氧脱氢酶的辅酶.这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性,因此在酶活性测定时,就要保证辅基或辅酶的供给.6．激活剂 有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂,Cl-是淀粉酶的激活剂.因此在酶活性测定时,也要满足酶对激活剂的需要.7．抑制剂 酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制,后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制.重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+,K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制.抑制剂使酶活性降低,在测定酶活性时,应避免抑制剂的影响.综上所述,测定酶活性时,最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则.
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植酸酶活性测定应注意的几个问题
　　1 温度
　　植酸酶作为一种酶制剂，对温度非常敏感，温度低会降低它的生物活性;温度高也会降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在检测过程中对温度的控制则显得非常重要，国标要求植酸酶活性测定时的温度为(37±0.1)℃。在33℃时植酸酶不能很好地发挥其活性，酶活与其真实值相比约低10%;在40℃时，部分植酸酶会失活，酶活与其真实值相比约低8%。另外，水浴加热时，水浴液面要超过试管内反应液液面，使其在规定时间内充分反应。
　　2 pH值
　　pH值在酶活测定时影响很大，国标要求pH值为5.5。当pH值为3.0时，植酸酶活力基本消失。尽量不要用酸度计来调节缓冲液的pH值，因为酸度计存在一定的误差，使用时间长了会发生钝化，使测定的pH值不准。可以通过计算缓冲溶液中H+浓度的方法来配制一定pH值的溶液。如：①配制0.25mol/l乙酸缓冲液，加入34.02g三水乙酸钠、2.78ml浓盐酸，完全溶解后定容至1 000ml，用精密pH试纸测定溶液pH值为5.0。笔者曾用酸度计对照，配制上述pH值溶液需加入浓盐酸6ml，1：3盐酸约20ml，此溶液pH值实际上已经低于5.0，由此说明此酸度计已经反应迟钝。②配制0.25mol/l、pH值5.50的乙酸缓冲液，需加入34.02g三水乙酸钠、1.24ml浓盐酸，完全溶解后定容至1 000ml，用精密pH试纸测定溶液pH值为5.50。
　　3 底物植酸钠的型号
　　植酸钠有两种型号，一种是Sigma p-3168，分子量为923.8;另一种是Sigma p-8810， 分子量为660.03。根据国标要求，植酸钠应为Sigma p-3168，笔者在实验中发现Sigma p-3168植酸钠底色浅，且作磷标准曲线时梯度较好(见表1、表2)。
　　由表1、表2可以看出检测植酸酶活性时用Sigma p-3168为反应底物较好。
　　4 离心速度和时间
　　当水浴30min终止酶解反应后，需要进行离心。国标要求4 000r/min，离心10min。若以3 000r/min离心10min，则离心不彻底，测吸光度时发现标准曲线吸光度不呈梯度;以5 000r/min离心10min时，发现标准曲线各梯度的吸光度与以4 000r/min离心10min时相比偏低。如果应用国标改进法，乙酸缓冲液中加入了牛血清白蛋白，离心时间需要15min。笔者曾用国标改进法进行了时间对比实验，测定酶活时离心10min和15min后样品的吸光度(见表3)。
　　由表3可见，离心时间对测定结果影响很大。
　　5 公式换算
　　在整个实验过程中即使做得再成功，若公式换算出错，将会前功尽弃。植酸酶绝对法测定酶活时，计算公式如下：
　　式中：C——根据实际样液的吸光值由曲线回归方程计算出的y值(U);
　　F——试样溶液反应前的总稀释倍数;
　　m——试样质量(g);
　　30——反应时间(min)。
　　其中F所代表的总稀释倍数换算时容易出现错误，现在我们举例说明：称取500IU植酸酶1.000 0g，用乙酸缓冲液溶解并稀释定容至100ml，从其中取出1ml继续稀释至12.5ml，稀释倍数为1 250;若称取1 000IU植酸酶 0.500 0g，用上述方法进行稀释，则稀释倍数为2 500，计算时若写成则错误，这样就多乘了2倍。应写成，这是在公式换算时应注意的问题。
　　(编辑：崔成德，)
我怎么没有看到你的表在哪啊？可否编辑一下。
论坛币 +30
该贴得到楼主的二次奖励！
因是PDF文件，我无法直接粘贴。只能用附件了。
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