草地早熟禾荧光定量PCR分析中内参基因的筛选
张兰, 檀鹏辉, 滕珂, 闫蒙举, 何春燕, 甘露, 尹淑霞.草地早熟禾荧光定量PCR分析中内参基因的筛选. 草业学报, ): 75-81
ZHANG Lan, TAN Peng-Hui, TENG Ke, YAN Meng-Ju, HE Chun-Yan, GAN Lu, YIN Shu-Xia.Screening of reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR in Kentucky bluegrass. Acta Prataculturae Sinica,): 75-81&&
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草地早熟禾荧光定量PCR分析中内参基因的筛选
尹淑霞*
北京林业大学林学院草坪研究所,北京 100083
*通信作者Corresponding author. E-mail:
作者简介:张兰(1990-),女,甘肃平凉人,在读硕士。E-mail:
基金项目:国家自然基金项目()和深圳市科技计划项目(JSGG34792)资助
为筛选出草地早熟禾实时荧光定量中的最适内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析检测6个传统内参基因 ACT、 GAPDH、 UBQ、 EF-1 α、18 s rRNA和 β-tublin在草地早熟禾不同组织器官、叶片不同发育期、非生物胁迫和不同激素诱导下mRNA的表达差异情况。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件综合评价6个候选内参基因的表达稳定性。结果表明,在不同组织、叶片不同发育期、激素诱导和非生物胁迫下,候选内参基因的表达稳定性存在差异。 GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中表达最为稳定; EF-1 α在非生物胁迫下表达最为稳定;不同激素下首选 β-tublin;在叶片不同发育期 ACT表达最为稳定。综上所述,通过筛选出不同条件下适宜的内参基因不仅有助于提高草地早熟禾基因表达分析的准确性,也为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供了理论参考。
草地早熟禾;
实时荧光定量PCR;
稳定性评价
Screening of reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR in Kentucky bluegrass
ZHANG Lan,
TAN Peng-Hui,
YAN Meng-Ju,
HE Chun-Yan,
YIN Shu-Xia*
Institute of Turfgrass Science, College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
To select the most stable reference genes of Kentucky bluegrass ( Poa pratensis) for real-time quantitative PCR, we assessed the mRNA expression in different tissues of six traditional candidate reference genes at various leaf development stages, under abiotic stress, or following various hormone applications. Genes assessed included ACT, GAPDH, UBQ, EF-1 α, 18 s rRNA and β-tubulin. The expression stabilities of these six reference genes were evaluated by geNorm, NormFinder and BestKeeper. It was found that mRNA expression of the candidate reference genes differed significantly between the tissue types, developmental stages, hormone applications or under abiotic stress. In Kentucky bluegrass leaves, GAPDH is recommended as the reference gene for analyzing the mRNA expression
EF-1 α was the most stable gene
β-tubulin was most consistent wit ACT was stably expressed in the different leaf development stages. In conclusion, use of the most appropriate reference genes under different conditions would enhance the accuracy analysis of gene expression in the Kentucky bluegrass. These findings may be applicable when selecting reference genes for analysis of mRNA expression in other members of the Poa genus.
Kentucky bluegrass;
quantitative real time PCR;
reference genes;
expression stability evaluation
实时荧光定量PCR是一种高效的生物技术之一, 是在mRNA水平上对基因表达进行的定量分析, 为避免样品之间和样品内部的差异, 必须引入拷贝数高、稳定表达的内参基因对目标基因的表达量进行校正[]。但越来越多的研究表明, 没有绝对稳定表达的基因存在, 任何一种内参基因的所谓稳定表达都只是在特定试验因素的作用下恒定。目前, 研究较多的内参基因都是参与植物基础新陈代谢过程中的基因[], 如肌动蛋白(actin, ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、多聚泛素酶(ubiquitin, UBQ)、翻译延伸因子(translation elongation factor 1A, EF-1α )、18s核糖体RNA(18s ribosomal RNA, 18s rRNA)、微管蛋白中的α 、β 家族(α /β -tublin)等。目前在植物研究领域关于候选内参基因筛选的报道很多, 且选择哪种合适的内参基因取决于植物品种、组织器官、处理因素及不同实验条件等[]。如在二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中, 多聚泛素连接酶基因4(BdUBi4)和多聚泛素连接酶基因10(BdUBi10)在不同组织器官和激素处理的样品中表达最为稳定, 而S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(s-adenosyl methionine decarboxylase, BdSAMDC)在逆境胁迫条件下的表达稳定性最好[]; 在珍珠粟(Pennisetum glaucum)中EF-1α 和翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factors 4A, PgEIF4A)表达最为稳定; PgEIF4A和苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase, PgMDH)在不同非生物胁迫下表达稳定性最高; MDH和酰基载体蛋白基因(acylcarrier protein, PgACP)适用于不同品种珍珠粟基因的表达分析[]。在与草地早熟禾(Poa pratensis)亲缘关系较近的小麦(Triticum aestivum)中, 传统内参基因EF-1α 表达最为稳定, 适于做不同非生物胁迫下基因的表达分析[]。肌动蛋白基因(ACTIN)和翻译控制肿瘤蛋白酶基因(translationally controlled tumor protein, TCTP)最适合作鸭茅(Dactylis glomerata)根组织在非生物胁迫下的内参基因[]。UBQ基因在苹果(Malus domestica)不同基因型、不同组织和果实不同发育期表达均比较稳定, 是其理想内参基因[]。对于柑橘(Citrus sinensis)来说, 因其在不同处理下, 各候选内参基因稳定性差异较大, 建议根据不同的试验内容选择不同的内参基因组合[]等。由此可见, 很有必要针对性地筛选不同条件下表达稳定的候选内参基因。草地早熟禾是一种应用极为广泛的冷季型草坪草, 随着其分子生物学研究的不断深入, 基因表达分析已经广泛用于揭示草地早熟禾基因调控的机理中, 因此筛选稳定的内参基因在基因表达分析中起着关键作用, 但鲜见有关草地早熟禾内参基因筛选的研究报道。鉴于生长发育调控和抗逆性是目前草坪草分子生物学研究的热点, 本研究选择了草地早熟禾在不同组织器官、叶片不同发育期、不同激素处理和非生物胁迫下的样品, 利用qRT-PCR方法分析了ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α 、18s rRNA和β -tublin这6个植物常用的传统内参基因mRNA的表达差异情况, 并运用geNorm[]、NormFinder[]和BestKeeper[]软件对检测结果进行表达稳定性分析, 以期通过对这些内参基因的检测和选择, 提高草地早熟禾基因表达分析的准确性, 以及为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供理论依据和参考。1 材料与方法1.1 材料本试验选用的是草地早熟禾品种巴润(Baron), 种子购自北京正道生态科技有限公司。试验于月, 在北京林业大学草坪实验室进行。先将种子播种于穴盘中, 发芽4周后, 将幼苗移至花盆中, 在长日照[14 h(昼)/10 h(夜), 光照强度2500 lx]人工气候箱中培养[培养温度(23± 2) ℃, 湿度60%~80%], 土壤基质为草炭、珍珠岩和蛭石(1∶ 1∶ 1), 每周浇灌霍格兰营养液。组织器官处理:分别采集健康生长的草地早熟禾的根系、叶片、叶鞘和茎。叶片生长期处理:采集健康生长草地早熟禾的幼叶(种子萌发后的第一片真叶)、分蘖期叶片和开花结籽后趋于衰老的叶片, 样本采集后液氮速冻, -80 ℃贮存备用。激素处理:选取长势一致的草地早熟禾样品分别喷施10 &#x003 mol/L脱落酸(abscisic acid, ABA)、10 &#x003 mol/L茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和10 &#x003 mol/L赤霉素(gibberellin, GA), 分别于喷施激素的第0、3、6和12 h剪取叶片, 液氮中速冻后保存于-80 ℃。非生物胁迫处理:用锡箔纸包裹草地早熟禾地上部分, 模拟黑暗胁迫; 以用剪刀修剪后的草样模拟物理损伤; 以12.5%的PEG 6000浇灌草地早熟禾, 模拟干旱胁迫; 以200 mmol/L NaCl浇灌草地早熟禾, 模拟盐胁迫; 分别于胁迫后的第0、3、6和12 h取样, 液氮中速冻后保存于-80 ℃。1.2 方法1.2.1 RNA提取与cDNA合成 按Trizol(Invitrogen, TaKaRa)总RNA提取试剂盒说明书提取各样品的总RNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其完整性、纯度和浓度。以总RNA为模板, 合成cDNA(全式金, AE301), 储存于-20 ℃冰箱中待用。1.2.2 内参基因cDNA片段的克隆 根据本实验室草地早熟禾的转录组数据, 用Primer Premier 5.0软件设计扩增6个内参基因部分片段的引物(), 以叶片cDNA为模板进行普通PCR扩增, 反应条件如下:95 ℃预变性10 95 ℃变性30 s, 55~60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环; 72 ℃再延伸5 12 ℃保温。所得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 纯化回收, 连接到pMD-19T载体上, 转化大肠杆菌感受态细胞DH5α , PCR检测阳性克隆后送北京睿博生物科技有限公司测序。表1Table 1表1(Table 1)
表1 用于克隆内参基因 cDNA片段的引物
Table 1 The primers sequences used in cloning the cDNA fragments of reference genes基因名称Gene name正向引物序列Forward primer sequence反向引物序列Reverse primer sequence退火温度Annealing temperature Tm (℃)扩增片段Amplicon length (bp)ACTTGTCAGTCACACAGTCCCGAATAATAAATCCATCAAACCA55804GAPDHCCATCTCCCCCCAAATCCTCCCCTTCCACCTCTCCAGTCC60672UBQGGAAGAAGGAAAAAGGAAAGGTCAGGACATAGTGGCAAAG56894EF-1α ACCAGAAAACAAGACGGAAGAGAATGTGGCTGTGAAGGAT5669418s rRNACACTTACCTTTTTCTATGCTGCTCGTTTGATTCTGATTTC56814β -tublinATCTTCCGCCCCGACAACTTTGTGCCCATTCCAGACCCAG55198
表1 用于克隆内参基因 cDNA片段的引物
Table 1 The primers sequences used in cloning the cDNA fragments of reference genes1.2.3 qRT-PCR引物设计及普通PCR扩增 参照qRT-PCR引物设计的一般原则, 根据上述得到的6个内参基因的cDNA序列, 用Primer Premier 5.0设计用于荧光定量PCR的引物()。为验证设计引物的准确性, 先进行普通PCR扩增, 反应条件为:94 ℃ 3 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环; 72 ℃ 5 min。待PCR反应结束后, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。表2Table 2表2(Table 2)
表2 用于定量分析候选内参基因的引物序列
Table 2 The primer sequence of selected reference genes used in qPCR analysis基因名称Gene name正向引物序列(5'-3')Forward primer sequence (5'-3')反向引物序列(5'-3')Reverse primer sequence (5'-3')扩增片段Amplicon length (bp)ACTTGAGCACATTCCAGCAGACCATAGACAAAGCCATCG188GAPDHCTTCATCACCACCGACTACATCAGCCAAAGACTGCTACCTCC135UBQGGAAGAAGGAAAAAGGAAGTAGCACACCAGTGAAGG110EF-1α ATCTTCCGTCTTGTTTTCTGGCTTTACACTTTATGCTTCC16518s rRNAGATAGGAAGAGCCGACATATACGAACCGTGAAAGCG156β -tublinATCTTCCGCCCCGACAACTTTGTGCCCATTCCAGACCCAG198
表2 用于定量分析候选内参基因的引物序列
Table 2 The primer sequence of selected reference genes used in qPCR analysis1.2.4 内参基因的荧光定量PCR分析 利用BIO-RAD CFX Connect 96孔荧光定量仪, 以康为世纪SYBR Green为反应Mix进行实时荧光定量分析。反应条件为:95 ℃ 30 95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s, 40个循环。每个样品进行3次生物学重复和4次技术重复。1.3 数据分析利用Excel 2010计算分析每个样品的Ct值和Δ Ct值(Δ Ct=Ct-Cmin, 式中:Cmin代表样品中的最低值, Ct代表每个样品的值), 然后将所得的数据分别用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析6个候选内参基因在草地早熟禾不同组织、生长期、激素处理和非生物胁迫下的表达稳定性, 比较稳定值大小及适宜选定的内参基因数量。2 结果与分析2.1 内参基因cDNA片段的克隆以草地早熟禾叶片的cDNA为模板, 对6个内参基因的cDNA片段进行扩增(图1), 阳性克隆检测结果显示扩增长度与预期相符, 用DNAMAN软件和NCBI Blast分析表明所得片段是目的基因。图1Fig.1 图1 6个内参基因cDNA片段的克隆Fig.1 Cloning of six reference genesM:M 1: β -tublin; 2: UBQ; 3: ACT; 4: GAPDH; 5: EF-1α ; 6: 18s rRNA.2.2 内参基因的普通PCR扩增以草地早熟禾叶片的cDNA为模板进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示, 各引物扩增目标片段清晰可辨(图2), 表明各候选内参基因引物特异性较好, 可用于后续的qRT-PCR研究分析。图2Fig.2 图2 内参基因片段的普通PCR扩增Fig.2 Normal PCR amplification of reference gene fragmentsM:M 1: EF-1α ; 2: UBQ; 3: 18s rRNA; 4: GAPDH; 5: ACT; 6: β -tublin.2.3 内参基因表达稳定性分析2.3.1 geNorm分析软件 通过将荧光定量PCR得到的循环阈值(Ct)转换为相对定量数据, 利用geNorm软件分析出某一基因与其他基因两两比值的对数转换值的平均变异度M值, 并绘制出M值折线图。M值越小, 该内参基因越稳定。geNorm软件的计算方法不受基因间极端比值和表达丰度差别的影响, 可通过该软件筛选出2个以上稳定表达的内参基因[]。由geNorm分析结果可知(图3), 不同候选内参基因在不同条件下的表达稳定性有所差异。在草地早熟禾叶片不同生长期(图3A), β -tublin和ACT的M值最小, 表达最为稳定; 在非生物胁迫下(图3B), 18s rRNA和EF-1α 表达最为稳定; 在不同激素处理下(图3C), 18s rRNA和β -tublin表达最为稳定; 而在草地早熟禾不同组织器官中(图3D), UBQ和GAPDH表达最为稳定。图3
图3 geNorm软件分析候选内参基因的表达稳定值(M)Fig.3Expression stability values (M) of candidate reference genes calculated by geNorm A:生长期D B:非生物胁迫A C:激素处理H D:组织器官Tissues and organs.2.3.2 NormFinder分析软件 NormFinder是基于方差分析的结果, 利用Δ Ct法对内参基因的表达稳定性进行直接评价, 与geNorm类似, 也产生基因表达稳定值, 然后根据稳定值大小排名, 但该软件只能筛选出1个稳定表达的内参基因[]。分析结果()显示, 在草地早熟禾不同组织和叶片不同发育期中, GAPDH基因适宜做内参基因; 在不同激素条件下18s rRNA基因更适合做内参基因进行基因表达分析; 在非生物胁迫下, EF-1α 最适宜做校正基因。表3Table 3表3(Table 3)
表3 NormFinder数据分析的稳定值及排名
Table 3 Stable value and ranking of data analysis by NormFinder基因Gene name组织Tissues生长期Development stages激素处理Hormone treatment非生物胁迫Abiotic stress稳定值Stable value排名Rankling稳定值Stable value排名Rankling稳定值Stable value排名Rankling稳定值Stable value排名RanklingGAPDH0.01410.00910.85241.7045β -tublin0.01720.01540.31021.429318s rRNA0.03030.07160.20811.1312ACT0.03030.01330.43831.6254UBQ0.03550.01852.28361.7576EF-1α 0.07460.01221.43450.7081
表3 NormFinder数据分析的稳定值及排名
Table 3 Stable value and ranking of data analysis by NormFinder2.3.3 BestKeeper分析软件 BestKeeper是通过标准偏差SD值对候选基因的稳定性进行评价和排序, SD值越小, 该基因的稳定性越好; 若SD> 1, 则认为该基因不稳定[]。分析结果表明(), 草地早熟禾不同组织中候选内参基因的稳定性由高到低排序是:18s rRNA> GAPDH> UBQ> ACT> β -tublin> EF-1α ; 不同生长期的顺序是:ACT> GAPDH> UBQ> EF-1α > β -tublin> 18s rRNA; 不同激素处理后稳定性由高到低的顺序是:β -tublin> 18s rRNA> ACT> GAPDH> UBQ> EF-1α ; 而草地早熟禾在非生物胁迫下候选内参基因的稳定性为18s rRNA> EF-1α > ACT> β -tublin> GAPDH> UBQ。表4Table 4表4(Table 4)
表4 BestKeeper数据分析的SD值及排名
Table 4 SD value and ranking of data analysis by BestKeeper基因Gene name组织Tissues生长期Development stages激素处理Hormone treatment非生物胁迫Abiotic stressSD值SD value排名RanklingSD值SD value排名RanklingSD值SD value排名RanklingSD值SD value排名RanklingGAPDH0.6620.1021.1242.245β -tublin1.2350.3450.7411.52418s rRNA0.2711.0060.8520.741ACT1.1740.0210.9531.363UBQ0.8030.1632.6052.546EF-1α 1.6960.1743.0160.972SD:标准偏差Standard deviation.
表4 BestKeeper数据分析的SD值及排名
Table 4 SD value and ranking of data analysis by BestKeeper从以上3个分析软件对6个候选基因在草地早熟禾不同组织器官、生长期、激素和非生物胁迫下稳定性分析的结果中, 可以看出:1)GAPDH最适合作草地早熟禾不同组织器官的内参基因, 其他候选内参基因稳定性较差, 不适合用于组织器官间的基因表达分析; 2)β -tublin和18s rRNA最适合作草地早熟禾在不同激素诱导下的内参基因; 3)EF-1α 最适合作草地早熟禾在非生物胁迫下的校正基因; 4)ACT最适合作草地早熟禾叶片不同发育时期的内参基因, 但其他5个基因NormFinder分析的M值均小于0.5(M值小于0.5可视为稳定性较好), 表达稳定, 这说明6个候选内参基因在草地早熟禾叶片发育不同时期的基因表达分析中均可用作校正基因。3 讨论目前, 在多年生黑麦草(Lolium perenne)[]、二穗短柄草[]、小麦[]和鸭茅[]等禾本科植物中已经有了关于内参基因稳定性筛选的报道, 结合本研究结果可以看出, 不同内参基因在禾本科中的稳定性各不相同。由于发现新的内参基因技术要求较高, 且步骤繁琐、工作量大, 因此, 本研究选用6个传统的基因作为候选内参基因, 它们本身拷贝数高、保守性强, 表达水平一致。其中, GAPDH参与糖酵解过程中第一个ATP的形成等[]; β -tublin是细胞骨架微丝的基本构成单位; 18s rRNA参与编码核糖体核基因[], 并参与核糖体循环[]。ACT因其保守性是研究和使用较多的看家基因, 它参与细胞分裂等很多重要的细胞生理活动[, ], 但并不是所有的物种都适合用ACT做内参基因; UBQ基因参与生物体内诸如基因转录、细胞死亡等生理活动[]。植物延伸因子EF-1α 在蛋白质合成延伸过程中起重要作用, 是真核生物细胞内的第二大类蛋白[]。3种分析方法结果表明, 在非生物胁迫下, 草地早熟禾EF-1α 基因的表达稳定性最好, 可能是物种亲缘关系相近, 该结果与非生物胁迫下多年生黑麦草[]和毒麦(Lolium temulentum)[]最适合内参基因的结果相一致; ACT作为内参基因曾广泛应用于多种动植物的基因表达分析中, 但越来越多的试验证明, ACT在不同的条件下表达并不稳定, 且更容易受外界因素的影响。在本研究中, 从综合分析结果来看, ACT仅在叶片同发育期表达最为稳定。即使GAPDH在木瓜(Carica papaya)[]、水稻(Oryza sativa)[]和烟草(Nicotiana tabacum)[]等植物中不适合作不同组织器官的内参基因, 但本研究结果表明, GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中稳定性最好, 是首选的内参基因。在本试验中, 18s rRNA在不同条件下表达丰度最高, 稳定性较好, 但考虑到18s rRNA易受不同样本所提取的RNA质量、rRNA和mRNA不恒定比例、药物及目标基因表达丰度与其相差太大等影响, 不建议使用18s rRNA作为内参基因, 但若目标基因表达丰度较高, 18s rRNA也是不错的选择。而且根据试验需要, 也可以选择两个或两个以上内参基因组合进行基因表达性分析。本研究利用3个不同的软件分析以上6个候选内参基因在草地早熟禾组织器官、叶片不同生长发育期、激素诱导和非生物胁迫下的表达稳定性, 结果显示在不同条件下, 各候选内参基因的稳定性存在一定的差异, 可能是由于组织样品和胁迫环境的不同导致各个候选基因参与的细胞代谢不同所致[]。当然, 在分子生物技术突飞猛进的基因组时代, 草地早熟禾后期内参基因的筛选肯定不再局限于几个传统的内参基因, 可以通过利用模式植物对其进行全基因组搜索并通过实验验证来获取可靠基因[]; 也可以对草地早熟禾进行全基因组测序来发现更多未知且恒定表达的内参基因。4 结论本研究对草地早熟禾6个内参基因(ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α 、18s rRNA和β -tublin)进行荧光定量PCR表达稳定性分析, 结果表明, 在研究草地早熟禾不同组织器官的基因表达分析时, 建议选择GAPDH作为内参基因; 研究叶片不同发育期的基因表达分析时首选ACT基因; 虽然EF-1α 表达丰度较其他5个候选内参较低, 但因其在非生物胁迫下稳定性最好, 因此, 研究草地早熟禾非生物胁迫下基因的表达分析首选EF-1α ; 研究草地早熟禾在不同激素诱导下基因的表达分析时建议选择β -tublin基因。本研究筛选出的不同条件下适宜的内参基因将有助于提高草地早熟禾基因表达分析的准确性, 也为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供了理论依据和参考。
The authors have declared that no competing interests exist.
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... 实时荧光定量PCR是一种高效的生物技术之一,是在mRNA水平上对基因表达进行的定量分析,为避免样品之间和样品内部的差异,必须引入拷贝数高、稳定表达的内参基因对目标基因的表达量进行校正[1] ...
... 目前,研究较多的内参基因都是参与植物基础新陈代谢过程中的基因[2],如肌动蛋白(actin, ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、多聚泛素酶(ubiquitin,UBQ)、翻译延伸因子(translation elongation factor 1A,EF-1#cod#x003b1 ...
... 目前在植物研究领域关于候选内参基因筛选的报道很多,且选择哪种合适的内参基因取决于植物品种、组织器官、处理因素及不同实验条件等[3] ...
... 如在二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中,多聚泛素连接酶基因4(BdUBi4)和多聚泛素连接酶基因10(BdUBi10)在不同组织器官和激素处理的样品中表达最为稳定,而S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(s-adenosyl methionine decarboxylase,BdSAMDC)在逆境胁迫条件下的表达稳定性最好[4] ...
... 3 讨论目前,在多年生黑麦草(Lolium perenne)[13]、二穗短柄草[4]、小麦[6]和鸭茅[7]等禾本科植物中已经有了关于内参基因稳定性筛选的报道,结合本研究结果可以看出,不同内参基因在禾本科中的稳定性各不相同 ...
... MDH和酰基载体蛋白基因(acylcarrier protein,PgACP)适用于不同品种珍珠粟基因的表达分析[5] ...
... 表达最为稳定,适于做不同非生物胁迫下基因的表达分析[6] ...
... 3 讨论目前,在多年生黑麦草(Lolium perenne)[13]、二穗短柄草[4]、小麦[6]和鸭茅[7]等禾本科植物中已经有了关于内参基因稳定性筛选的报道,结合本研究结果可以看出,不同内参基因在禾本科中的稳定性各不相同 ...
... 肌动蛋白基因(ACTIN)和翻译控制肿瘤蛋白酶基因(translationally controlled tumor protein,TCTP)最适合作鸭茅(Dactylis glomerata)根组织在非生物胁迫下的内参基因[7] ...
... 3 讨论目前,在多年生黑麦草(Lolium perenne)[13]、二穗短柄草[4]、小麦[6]和鸭茅[7]等禾本科植物中已经有了关于内参基因稳定性筛选的报道,结合本研究结果可以看出,不同内参基因在禾本科中的稳定性各不相同 ...
... UBQ基因在苹果(Malus domestica)不同基因型、不同组织和果实不同发育期表达均比较稳定,是其理想内参基因[8] ...
... 对于柑橘(Citrus sinensis)来说,因其在不同处理下,各候选内参基因稳定性差异较大,建议根据不同的试验内容选择不同的内参基因组合[9]等 ...
... geNorm软件的计算方法不受基因间极端比值和表达丰度差别的影响,可通过该软件筛选出2个以上稳定表达的内参基因[9] ...
... -tublin这6个植物常用的传统内参基因mRNA的表达差异情况,并运用geNorm[10]、NormFinder[11]和BestKeeper[12]软件对检测结果进行表达稳定性分析,以期通过对这些内参基因的检测和选择,提高草地早熟禾基因表达分析的准确性,以及为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供理论依据和参考 ...
... Ct法对内参基因的表达稳定性进行直接评价,与geNorm类似,也产生基因表达稳定值,然后根据稳定值大小排名,但该软件只能筛选出1个稳定表达的内参基因[10] ...
... -tublin这6个植物常用的传统内参基因mRNA的表达差异情况,并运用geNorm[10]、NormFinder[11]和BestKeeper[12]软件对检测结果进行表达稳定性分析,以期通过对这些内参基因的检测和选择,提高草地早熟禾基因表达分析的准确性,以及为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供理论依据和参考 ...
... 1,则认为该基因不稳定[11] ...
... -tublin这6个植物常用的传统内参基因mRNA的表达差异情况,并运用geNorm[10]、NormFinder[11]和BestKeeper[12]软件对检测结果进行表达稳定性分析,以期通过对这些内参基因的检测和选择,提高草地早熟禾基因表达分析的准确性,以及为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供理论依据和参考 ...
... 3 讨论目前,在多年生黑麦草(Lolium perenne)[13]、二穗短柄草[4]、小麦[6]和鸭茅[7]等禾本科植物中已经有了关于内参基因稳定性筛选的报道,结合本研究结果可以看出,不同内参基因在禾本科中的稳定性各不相同 ...
... 基因的表达稳定性最好,可能是物种亲缘关系相近,该结果与非生物胁迫下多年生黑麦草[13]和毒麦(Lolium temulentum)[21]最适合内参基因的结果相一致 ...
... 其中,GAPDH参与糖酵解过程中第一个ATP的形成等[14] ...
... 18s rRNA参与编码核糖体核基因[15],并参与核糖体循环[16] ...
... 18s rRNA参与编码核糖体核基因[15],并参与核糖体循环[16] ...
... ACT因其保守性是研究和使用较多的看家基因,它参与细胞分裂等很多重要的细胞生理活动[17,18],但并不是所有的物种都适合用ACT做内参基因 ...
... ACT因其保守性是研究和使用较多的看家基因,它参与细胞分裂等很多重要的细胞生理活动[17,18],但并不是所有的物种都适合用ACT做内参基因 ...
... UBQ基因参与生物体内诸如基因转录、细胞死亡等生理活动[19] ...
... 在蛋白质合成延伸过程中起重要作用,是真核生物细胞内的第二大类蛋白[20] ...
... 基因的表达稳定性最好,可能是物种亲缘关系相近,该结果与非生物胁迫下多年生黑麦草[13]和毒麦(Lolium temulentum)[21]最适合内参基因的结果相一致 ...
... 即使GAPDH在木瓜(Carica papaya)[22]、水稻(Oryza sativa)[23]和烟草(Nicotiana tabacum)[24]等植物中不适合作不同组织器官的内参基因,但本研究结果表明,GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中稳定性最好,是首选的内参基因 ...
... 即使GAPDH在木瓜(Carica papaya)[22]、水稻(Oryza sativa)[23]和烟草(Nicotiana tabacum)[24]等植物中不适合作不同组织器官的内参基因,但本研究结果表明,GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中稳定性最好,是首选的内参基因 ...
... 即使GAPDH在木瓜(Carica papaya)[22]、水稻(Oryza sativa)[23]和烟草(Nicotiana tabacum)[24]等植物中不适合作不同组织器官的内参基因,但本研究结果表明,GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中稳定性最好,是首选的内参基因 ...
... 本研究利用3个不同的软件分析以上6个候选内参基因在草地早熟禾组织器官、叶片不同生长发育期、激素诱导和非生物胁迫下的表达稳定性,结果显示在不同条件下,各候选内参基因的稳定性存在一定的差异,可能是由于组织样品和胁迫环境的不同导致各个候选基因参与的细胞代谢不同所致[25] ...
... 当然,在分子生物技术突飞猛进的基因组时代,草地早熟禾后期内参基因的筛选肯定不再局限于几个传统的内参基因,可以通过利用模式植物对其进行全基因组搜索并通过实验验证来获取可靠基因[26] ...
草地早熟禾荧光定量PCR分析中内参基因的筛选
[张兰, 檀鹏辉, 滕珂, 闫蒙举, 何春燕, 甘露, 尹淑霞*]