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生物素及生物素化
图一、AviTag氨基因酸结构
生物素可以与亲和素、链霉亲和素非常紧密地结合，因而，生物素标记蛋白广泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域，以及作为亲和分离制剂，用于相应配基的分离与纯化。传统的生物素标记方法通常利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，活化生物素可以与各种生物大分子结合，用于标记各种蛋白质(包括抗体、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、荧光素、胶体金等。由于反应条件比较剧烈，化学方法生物素化过程中，一些相对敏感的蛋白容易失活；同时，由于活化的生物素不具有识别特定蛋白质的能力，因而化学方法生物素化是非特异的。
生物素连接酶 (Biotin Ligase)能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素受体蛋白－AviTag上，使蛋白生物素化。AviTag是15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端，融合表达后，在体内或体外均可被生物素连接酶生物素化。
与化学生物素标记法相比，生物素AviTag标签系统具有以下几大优点：
无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的AviTag位点轻易且有效地被生物素化；
由于此类生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；
每一个AviTag仅可以加入一个生物素分子，对整个蛋白的活性和功能影响很小。
Biotin ligase催化的生物素化应用实例：
（选取数个基因，表达载体为WG05，同时含有6×His Tag、Sumo与AviTag）
图二、通过AviTag进行生物素化的重组蛋白示意图
通过Biotin Ligase生物素化的重组蛋白的检测：
图三、通过Biotin Ligase进行生物素化的重组蛋白的表达及检测
考马斯亮蓝染色
Anti-His Antibody作为一抗进行Western Blotting
HRP-Streptavidin直接反应检测生物素化的重组蛋白
1．Protein ladder
2～11．选取10个基因表达产物（经过Biotin Ligase催化生物素化）
12．未经生物素化的基因表达产物
13．对照，重组β-葡萄糖苷酸酶（His-Gus）
14．对照，参与酶促反应的Biotin Ligase
与抗原抗体反应相比，生物素化的检测灵敏度更高：
图四、通过Biotin Ligase生物素化的重组蛋白进行不同方法检测
丽春红染色
Western Blotting，DAB显色
1,8,9．Protein ladder
2,10．对照，重组β-葡萄糖苷酸酶（His-Gus）
3～7,11～15．不同浓度的重组蛋白
Copyright&
广州复能基因有限公司 版权所有 粤ICP备号 &&酶联免疫吸附试验 【范文十篇】
酶联免疫吸附试验
范文一：酶联免疫吸附试验（ELISA）——直接法
酶联免疫吸附试验（enzyme linked
immunosorbent assay，ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中，以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，与相应抗原IgG结合，标记的酶可催化底物（邻苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
二、材料：
1. 人IgG包被的微量酶标反应板（1：1万，1：10万，1：40万，1：80万，1：100万），
2. 酶标抗人IgG抗体稀释液、 洗涤液（PH7.4，0.01M PBS-Tween20）、底物溶液，
3. 微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37℃恒温箱等。
三、方法：
1. 人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入第1至5孔，设第6孔为对照。置37℃恒温箱2小时，取出，移入4℃冰箱过夜。取出，用洗涤液洗3次，3分钟/次（略）。
2. 用含小牛血清（BSA）的PH7.4 PBS封闭，置37℃恒温箱，30分钟，取出。用洗涤液洗3次，3分钟/
次（略）。
3.用微量移液器吸取100ul酶标抗人IgG抗体，分别加入第6至1孔。置湿盒中，于37℃恒温箱中孵育30分钟。
4. 取出酶标板，用洗涤液洗3次，3分钟/次。
5. 按第6孔至第1孔的顺序，每孔各加100ul的底物溶液，置37℃恒温箱中10-15分钟。
6. 观察显色反应。
范文二：酶联免疫吸附试验ELISA
一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
应用学科：
免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（二级学科）
酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体
自从Engvall和Perlman(1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但
酶联免疫吸附试验专用仪器
随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
如今ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
辣根过氧化物酶
过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。
碱性磷酸酶
系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。
良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液
（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
⑴ 酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。
⑵ 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量
结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，
1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时最好。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
范文三：酶联免疫吸附试验（ELISA）
1. 将试剂盒及血清样本复温。
2. 标准品：1ml 标准品稀释液（standard diluent）重悬标准品（standard），轻微震荡10min，避免形成泡沫，此时，标准品的浓度为2000pg/ml。按照下图倍比稀释标准品，标准品稀释液的浓度为0 pg/ml
3. 分析稀释液A、B：6ml双蒸水将6ml
2×分析稀释液A、B稀释至12ml，稀释后的工作液不能冻存。
4. 检测试剂A、B：点动离心检测试剂A、B，用分析稀释液A、B分别以1:100将检测试剂A、B稀释成工作浓度。
5. 洗液：用双蒸水将20ml
30×洗液稀释成600ml。 注意事项：
1. 不要在96孔板里面做梯度稀释实验。
2. 实验前15min制备标准品溶液，不要直接在37℃溶解试剂。
3. 小心重悬标准品和检测试剂A、B至沉淀完全溶解，避免形成气泡。
4. 重悬后的标准品、检测试剂A、B只能使用一次。
5. 如果洗液中有沉淀形成，复温至室温，至沉淀完全溶解。
6. 建议使用双蒸水来稀释试剂盒样本。
实验过程：
1. 实验设计：7个标准品孔、1个空白孔。向96孔板的每个孔中
加入100 ul 标准品及样本，贴上封板胶，37℃孵育2h。
2. 弃孔中液体，不要洗。
3. 每孔中加入100 ul 检测试剂A的工作液，贴上封板胶，37℃
4. 弃孔中液体，350 ul 洗液清洗孔三次，每次1~2min。
5. 每孔中加入100 ul 检测试剂B的工作液，贴上封板胶，37℃
孵育30min。
6. 按照步骤4重复洗板5次。
7. 每孔中加入底物溶液90ul，贴上封板胶后，37℃避光孵育
15~25min（不超过30min），溶液颜色变蓝。
8. 每孔中加入50ul终止液，溶液颜色变黄，轻轻拍打板的边缘
确保液体混匀。
9. 去除板底的液体，立即在酶标仪上450nm检测。
注意事项：
1. 准备工作：使用合适数量的孔，其余孔于-20℃保存。
2. 每一步加样时间不要超过10min，加样时轻轻混匀并避免形成
3. 实验过程中保持孔湿润。
4. 清洗过程中尽量去除所有的液体，尤其在清洗的最后一步。
5. 控制反应时间：加入TMB底物后每10min观察颜色变化，避
免反应过度。
6. TMB底物溶液容易污染，请避光保存。
结果计算：
对数作图，横轴为OD值的对数，纵轴为浓度的对数
范文四：酶联免疫吸附实验详解
ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；
（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；
（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的
后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook
effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体
的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
范文五：酶联免疫吸附实验
免疫酶技术是本世纪60年代末期发展起来的一种免疫检测方法，是目前最广泛应用的标记免疫技术。1966年Nakene和Pierce共同发表了《酶标抗体：制备和抗原定位中的应用》，首先提出了免疫酶技术的基本原理。1971年Engvall和Perlmann发表《酶联免疫吸附试验测定IgG含量》一文，使免疫酶技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法。目前免疫酶技术已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学等。由于其具有灵敏度高、试剂稳定、设备简单、操作安全等优点，近几年也将其应用到食品领域中来检测某些食品中的生理活性物质。
一、基本概念
1、免疫：笼统地概括起来，免疫就是人和动物机体防御、排除外来物质(异物)进人体内，同时识别和清除体内死亡、变性物质和平定体内叛乱分子突变细胞，以保护和稳定自身的防护机制。
2、抗原：抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免疫应答，产生抗体和致敏效应淋巴细胞，并在体内外与之特异性结合，发生免疫反应的物质。
3、抗体：是能与相应的抗原专一性结合的蛋白质分子，和机体其他生物大分子一样是细胞的产物，分泌到体液中或表现在细胞表面上。
4、抗原、抗体反应：抗原和抗体在体外的反应亦称血清学反应。这类反应可借助免疫学方法进行检测。
二、抗体定量检测方法及其原理
定量分析抗体的常用方法有扩散法、酶联免疫吸附法和火箭免疫电泳法等。
1、免疫扩散法
1.1、单向免疫扩散法
原理：将待检抗原滴加于含相应抗体的琼脂板小孔中，经一定时间扩散后。形成乳白色的沉淀坏，在一定浓度范围内，抗原的含量与沉淀坏直径成正比。可以先用己知不同浓度的标准抗原制成标准曲线，再根据测试样品沉淀环直径的大小，从标准曲线上查出样品中抗原的相应含量。
1.2双向免疫扩散法
原理：可溶性抗原与已知可溶性抗体分别加入相邻的琼脂糖凝胶板上的小孔内，在电解质存在下让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据最大稀释度与已知标准品最大稀释度之比，可计算出抗体含量。
2、火箭免疫电泳法
原理：抗原在电场力的作用下向前移动，当抗原在通过含有一定量单一抗体的琼脂凝胶时，即形成抗原抗体复合物，比例合适即沉淀下来。因抗体迁移率低，而抗原随电泳向前移动，因而使抗原、抗体形成圆锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，峰的高度与抗原的浓度呈正比。
3、酶联免疫吸附法((ELISA)
原理：ELISA可用于测定抗体，也可用于检测杭原。其基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）； ②酶标记的抗原或抗体（标记物）； ③酶作用的底物（显色剂）。
ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。
根据检测目的和操作步骤不同，有以下三种类型的常用方法：
此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体。加人待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。
3.2双抗体夹心法
此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加人待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加人酶标板中。
此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体。加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竟争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。
三、酶联免疫吸附法测定抗体含量（竞争法）
1、仪器设备
酶联免疫检测仪(Bio－550)；酶标板 (96孔)；微量注射器。
(1)HRP标记羊抗兔Ig G(1:1 000，国产)；标准牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；
(2)包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存, Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸馏水稀释至100 mL。
(3)稀释液与洗涤液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸馏水加至1000mＬ。
(4)封闭液：含0.1%明胶0.01mol/L PBS， pH7.4。
(5)邻苯二胺底物溶液(临用前配制)：临用前将Na2HPO4·12H2O 2.9g,柠檬酸0.51g溶于100mL蒸馏水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。
(6)终止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸馏水中加入98%浓硫酸76mL混均即可。
3、操作方法
（1）将抗原结合在酶标板上。取标准IgG（10mg/mL）用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加标准抗原的两孔为对照，为反应的0%值，将反应板于4℃过夜（8个样品，分3个平行，4个100%值孔；共28+2孔）。
（2）标准牛IgG与初级抗体一兔抗牛血清的反应。将标准IgG（10mg/mL）用稀释液作二倍稀释得到一系列不同浓度的标准牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀释好的200μL的兔抗牛血清中，其中4个不加标准牛IgG作为测量时的100%值。4℃反应过夜。
（3）封闭板。将包被好的酶标板孔内液体倾去，进行洗涤，各孔加200μL洗涤液后室温下放置1min，倒掉，如此重复4次后，在吸水纸上拍干，加封闭液进行封闭，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封闭液）。封闭后，如前述洗涤。
（4）向酶标板中加人标准抗原和抗体的混合物。将标准牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶标板孔内，同是4个未加抗原的100%值的平行样也加入酶标板中。37℃放置2h，再洗板4次。
（5）加人HRP标记的羊抗兔Ig G。洗涤后每孔加100μL稀释好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗涤。
（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗处反应20min后，每孔加人50μL结束反应液以终止反应。
（7）吸收测定。用酶联免疫检测仪测定波长为492nm下的吸光值。
（8）数据处理。标准曲线是以Ig(标准牛IgG含量)对B/Bo作图，求得线性方程。其中，C为标准牛IgG含量；B为不同浓度标准牛IgG吸收值与0%吸收值之差;Bo为100吸收值与0%吸收值之差。
酶联吸附测定标准牛IgG标准曲线
范文六：酶联免疫吸附试验
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酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62 对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算： IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。 HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4 结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量 结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时最好。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下。
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；
② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清； ③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。 ⑵ 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干 ② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干 ③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干 ④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。
⑶ 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。
双抗体夹心
本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干 ② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干 ③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液 ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
双夹心ELISA
此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为：
① 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干 ② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干 ④ 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干 ⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液 ⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。
此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为： ① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液 ④ 用ELISA检测仪测定OD值。
被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干 ② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干 ③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干 ④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干 ⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干 ⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液 ⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。
本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。
抗体捕捉ELISA
本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：
① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干 ③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干 ④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液 ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：
⑴载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。
⑵ 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
⑶ 加被检血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。
⑷ 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。
⑸显色 加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。 ⑹ 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。
（C－ELISA） C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais,B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：
⑴ 首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭； ⑵ 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；
⑶ 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次； ⑷ 加入底物液显色； ⑸ 测定OD值。
酶联免疫(ELISA)是如今检验科常用的免疫学检测方法之一，其操作简单，无须特殊设备，使其在各级医院都有应用。但是，如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性，因此，了解影响实验的因素，减少差错事故的发生是极其必要的。
实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。首先应具备一个良好的思想素质，因为我们的服务对象是人，我们的道德水平直接关系到人们的健康和生命安危，如果马马虎虎。三心二意，难免会有差错事故发生，我们应该热爱专业，耐心细致。在工作中如标本混淆、张冠李戴、报告单发错等都有可能造成严重后果；其次文化素质和技术素质，我
们要熟练掌握本专业的基本理论和基本技术，认真学习新理论新知识，努力提高自己的业务水平，创造一个能够胜任本职工作的技术平台。良好的心理素质就是要勇于面对工作生活中的挫折，在繁忙工作中，有条不紊，冷静沉着的处理有关事务。人员素质问题是影响检验结果的首要因素。
标本处理因素
实验室人员收到标本后应认真查对，对不符合要求的标本和申请单要拘收，合格标本要及时分离血清，避免溶血，提取血清时不应混有大量纤维蛋白或细胞成分。对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录，标本管上最好标上待检者姓名、日期。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，并充分混匀再用。
1、操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18 C～25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。
2、正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。
3、手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流，造成孔问污染，导致假阴性或假阳性。
4、要保证加液量一致 我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量不准，造成显色不统一，判断错误。
5、显色液量不可过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。
6、试剂的影响因数：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。 应用免疫 ?
凝集[反应]
? 间接凝集抑制反应 ? 沉淀[反应] ? 后带现象
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? 反向间接凝集反应 ? 沉淀素 ? 沉淀试验
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被动血凝反应 ? 协同凝集[反应] ? 带现象
? 环状沉淀试验
? ? ? ? ? ?
免疫电泳 免疫固定电泳
补体结合抑制试验 免疫珠试验 血凝试验
免疫比浊法 对流免疫电泳 反向免疫印迹 补体结合试验 红细胞凝集试验 鞣酸化红细胞试验
双向免疫扩散试验 火箭免疫电泳 中和试验
间接补体结合试验 乳胶凝集试验 絮凝试验
间接凝集反应 ? 沉淀原 ? 前带现象 ? 乳环状试验
? 定量单向凝胶扩散验
? 交叉免疫电泳 ? 病毒中和试验 ? 免疫亲和层析 ? 冷凝集素
? 血凝抑制试验
范文七：[关键词] ELISA；检验；因素 　　 　　由于酶联免疫吸附试验（ELISA）以灵敏度较高、，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定［1］，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，一般涉及到样本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，尤以加样、温育和洗板步骤为甚，只有避免了这些因素才能保证实验结果的准确性和可靠性［2］。我将各个环节应注意的问题总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。 　　 　　1 样本的收集保存 　　 　　 疾病预防控制系统用于ELISA测定的样本最常用的是血清（浆），在处理和保存样本方面要考虑以下几个方面：①要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素集团，有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色；②血液标本存放足够的时间，使纤维蛋白充分析出。最好离心后使用。必要时可置37℃，2h促进凝集。要注意尽量避免细菌污染。细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用或对实验产生非特异性干扰；③以无菌操作分离的血清样本可在2～8℃保存1周，需长时间保存者，应在- 80℃以下冻存，冰冻保存的血清样本禁忌反复冻融，防止假阴性结果的出现；④血清样本如出现浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取其上清液检测。 　　 　　2 试剂准备 　　 　　在实验开始前，从4℃取出的试剂，要平衡到室温后方可使用。室温控制在18～25℃。这是试剂准备最为关键的一步，目的是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度较快地达到所要求的温度，以满足测定要求，防止对一些弱阳性样本的检测出现假阴性。 　　 　　3 加血清样本和反应试剂 　　 　　血清样本要用微量移液器加入，必须注意：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异性吸附；溅出会对邻近孔产生污染；出现气泡则反应液界面有差异。加入试剂时，如用滴瓶滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异性吸附，引起非特异性显色。所以，有时用相同的试剂盒测同一份样本会出现这次结果为阳性而下次结果为阴性的现象。 　　 　　4 温育 　　 　　温育是ELISA测定中影响测定成败最关键的因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。要保证在设定的温度下有足够的反应时间［3］，严格来讲，这个时间应该从微孔板反应溶液温度由室温升至37℃时计时。平时实验中，往往是从微孔板一放入温箱即开始计时，这样很容易造成弱阳性样本因温育时间不够而测不出的问题。所以，温育应尽量采用水浴，让微孔板浮于水面上；或将浸透水的纱布放在大饭盒中成一个湿盒，放温箱中，这就可以使反应溶液温度迅速与温箱平衡。 　　 　　5 洗板 　　 　　固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中的非特异成份分离开来，来保证ELISA测定的特异性。所以洗板对于ELISA测定也是极其关键的，它将非特异吸附的成份分离开。洗板时要注满洗液，防止相邻孔间的污染［4］，但不能有气泡。洗板机使用前应检查管道是否通畅，或漏气，针头是否有堵塞。洗涤液要勤更换，以免长菌而影响结果。 　　 　　6 显色 　　 　　显色要注意保证足够的反应时间［5］，严格按说明书要求做。从理论上讲，以HRP为标记酶的ELISA试剂，37℃ 30 min才可以使HRP的的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部分催化反应即可完成。否则，弱阳性 　　样本孔因反应不充分而被漏检。同时，以OPD为底物者，显色过程要避光进行。 　　 　　7 比色 　　 　　比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内样本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，所以，在ELISA测定比色时最好使用双波长比色。 　　 　　8 结果判断、报告 　　 　　区县级疾病预防控制中心实验室的ELISA测定一般为定性测定，对样本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的判定，分别用“阳性”和“阴性”表示[6]。其“阳性”和“阴性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判断值（Cut-off）。 　　 　　参考文献 　　[1] 宋炳荣,杜彩霞,崔娜,等.ELISA一步法检测乙型肝炎病毒标志物影响因素的实验研究［J］.实用医技杂志,):65. 　　［2］邓永福.ELISA实验影响因素探讨[J].四川省卫生管理干部学院学报,):17-18. 　　［3］徐锡霞,邓巍.温育条件对ELISA定性测定HBsAg结果的影响[J].实用肝脏病杂志,):18-20. 　　［4］裴洪贵,夏志鸿,甘云波.ELISA法检测HBsAg污染途径初探[J].贵州医药,): 90-91. 　　［5］张志奇,张战军.ELISA检测显色结果影响因素的分析[J].洛阳医专学报,):72. 　　[6] 于振喜,李连洁.用HIV法检测HIV抗体时如何避免“花板”［J］.中国医药导报，):56. 　　 (收稿日期：)
范文八：【摘要】目的 比较金标免疫层析试验(GICA)与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBsAg的结果符合率，以了解GICA法的特异性与敏感度。方法用GICA法和ELISA法平行检测受检者血清标本HBsAg。结果GICA法和ELISA法检测HBsAg的结果符合率为99.65%。结论 GICA法较ELISA法敏感度稍低，用GICA法检测HBsAg时存在一定程度的漏检率（即假阴性），即在低滴度HBsAg的血清标本时不宜使用GICA法；GICA法操作简便、快速,适用于临床急诊标本及健康人群的筛查，ELISA法灵敏度高、特异性强,适用于综合性医院常规检测。 　　【关键词】乙型肝炎表面抗原 金标免疫层析试验 酶联免疫吸附试验 特异性与敏感度 　　中图分类号：R3文献标识码：A文章编号：（-01 　　 　　乙型肝炎是目前流行最广泛、危害着人民健康最严重的病毒性肝炎之一。目前，乙肝病毒HBV血清标志物的常用检测方法有ELISA法，金标记免疫层析法和化学发光法。[1]我科多年来一直使用ELISA法检测HBV血清标志物，为了避免人为差错的发生，对经ELISA法测得HBsAg阳性的血清标本再次用GICA法复检，结果发现，对于少数HBsAg阳性的血清标本GICA法无法测出，呈阴性（实为假阴性）。于是，我决定用GICA法和ELISA法同时检测血清标本中HBsAg，加以比较。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本来源 日～12月31日我院门诊及住院患者静脉血清标本293份。 　　1.2 试剂和仪器 (1)试剂：GICA试纸条为英科新创科技有限公司生产，ELISA试剂盒为北京万泰生物药业有限公司生产，均在有效期内使用。(2)仪器：上海热电仪器厂 MK-3酶标仪与MK-2洗板机。 　　1.3 方法 293份血清标本以GICA试纸条和ELISA试剂盒平行检测HBsAg,严格按照说明书操作。 　　1.4 判定标准 　　ELISA法待测标本A值S/CO≥1.0者为HBsAg阳性。GICA法为检测线与对照线两条线同时出现紫红色为阳性，只出现对照线为阴性，若两条线都不出现表明试纸条失效。对于ELISA法检测阳性GICA法检测阴性的血清标本，再用ELISA法双孔复检，其中任一孔S/CO≥1.0即确定为阳性。 　　2 结果 　　GICA和ELISA法测定293份血清标本结果见表1。 　　表1 人群筛查结果比较表 　　从表1中可看出293份血清标本检测结果，GICA法的阳性检出率为8.87%，ELISA法的阳性检出率为9.22%，ELISA法的阳性检出率高于GICA法，说明用GICA法检测HBsAg时存在一定的漏检率（3.70%），二者的符合率为99.65%。以ELISA法为常规法验证GICA法的灵敏度为96.29%,特异度为100.0%。两法结果经X2检验，P>0.05，显示两种方法测定的HBsAg结果间差异无显著性。 　　3 讨论 　　GICA法和ELISA法均属于免疫学检测范畴，ELISA法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、可批量的进行定量和半定量测定等特点，是目前实验室应用最广的检测HBsAg的方法,但该方法易受加样、反应温度、反应时间、洗涤彻底性等诸多因素的影响。GICA法是一种在ELISA基础上发展起来的膜载体的免疫检测法，具有操作快捷、简便、灵敏，可单份检测、便于保存、不需特殊设备等特点，可最大限度地避免实验过程中各种因素对结果的影响，被广泛应用于临床对健康人群，急诊及无偿献血的现场筛查，[2]尤受标本量少的一些基层医院和个别机构的欢迎。 　　本组两种检测方法的符合率为99.65%，与有关文献报道基本一致（97.74%）[3]。尽管两种检测方法符合率较高，GICA法与ELISA法相比还是有漏检现象存在，漏检率为3.70%，故不能完全代替ELISA法，ELISA法仍是HBsAg临床免疫学诊断的主要依据。造成 GICA法漏检的原因主要有方法学上的差异，试剂本身的灵敏度，个别标本可能存在HBsAg亚型以及滴度，观测结果的时间短等[4]，所以建议在使用GICA法检测HBsAg时，应选择灵敏度高、质量好的GICA试纸条，而且出现阴性时，应适当延长反应时间，以便观察结果，以免造成HBsAg弱阳性的漏检。综合性医院一般不宜使用 GICA法常规检测患者的HBsAg，对于GICA法筛查阴性的临床标本，建议用ELISA法复检，以防漏检造成人为差错而延误诊断，甚至引起医患矛盾或医疗纠纷。 　　参考文献 　　[1] 叶应妩，王毓三，申子瑜. 全国临床检验操作规程, 第3版.南京：东南大学出版社，. 　　[2] 王小红，ELISA法与胶体金试纸条检测HBsAg的差异分析，工企医刊，2010，,23(1)：25-26 　　[3] 高丽,付鸿,李慧，等. 胶体金试纸法与酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒表面抗原的比较[J].中国计划免疫,)：51-53. 　　[4]卢敏，陆志檬.乙型肝炎的研究进展．国外医学?流行病学传染病学分册，．
范文九：酶联免疫吸附试验ELISA
一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体
由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，
ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）
、碱性磷酸酶、HRP应用最广。
1.辣根过氧化物酶（HRP）
过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：（1）邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；（2）联大茴香胺（OD）,产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；（3）5－氨基水杨酸（5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；（4）邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。
2.碱性磷酸酶
系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。
编辑本段抗体的酶标记方法及标记效果测定
1.标记方法
良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其
标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g
1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
2.酶标抗体标记效果测定
测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG
(1) 酶与抗体的活性 常用琼
脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。
(2) 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。
403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
结合物中酶总量=HRP
（mg/ml）×结合物溶液量
结合物产率=
结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时最好。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA（Dot-ELISA）;再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
1.间接ELISA
本法主要用于检测抗体。
DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下。
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；
② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；
③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。
(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。
2.双抗体夹心ELISA
本法主要用于检测大分子抗原。现以检
IBDV）的双夹
心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
3.双夹心ELISA
此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提
高试验的敏感性。此法的基本程序为：
① 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑥ 用ELISA
检测仪测定OD值。
4.竞争ELISA
此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为：
① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
④ 用ELISA检测仪测定OD值。
被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。
5.阻断ELISA
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 用200μl阻断缓冲液进行
封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。
本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。
6.抗体捕捉ELISA
本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则
可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：
① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干
待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
7.斑点ELISA（Dot-ELISA）
与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：
(1) 载体膜的预处理及抗原包被
蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈
中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。
(2) 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
(3) 加被检血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。
(4) 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。
(5) 显色 加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。
(6) 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。
（C－ELISA） C－ELISA（Cloth-ELISA
Blais, B. W.
等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：
(1) 首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；
(2) 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；
(3) 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；
(4) 加入底物液显色；
(5) 测定OD值。
范文十：酶联免疫吸附实验（ELISA）要点
1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行 包被。以下简述固相载体和包被过程。
2 固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较 强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准 的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特 点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、 比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但 用于间接法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板 由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。
常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保 温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部 读数的均数之差，应小于10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如 聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系 列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就是这一 ELISA测定项目的最合适的固相载体。
在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。ELISA板孔的吸附面积约为 200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA板孔的5倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸 附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的洗涤器， 使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为100-200ul，而小试管可 根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积极大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。以含 铁的磁性微粒作为ELISA固相载体，
反应后用磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。
3 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通 过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等 的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相 具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当 抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被 法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接 包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法（见2.2.4），试验的特异性、敏感性 均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特 殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如 30W紫外灯，75cm照射12小时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和 素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂 质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯 化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如 AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂 质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA，在反应中可出现假阳性，因不少受检者 受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚 不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在 ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高， 特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固 相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定 簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可 引起其他抗体的漏检。
5 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的）， 在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐 析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感 性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作 适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的 效果。
包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳 酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在 4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结 合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未 被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂 是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度 使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双 抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸 附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。