【求助/交流】基因测序结果分析问题_甘露儿吧_百度贴吧
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【求助/交流】基因测序结果分析问题
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用同一对引物在果实的不同时期扩增，均得到长度为146的片段，每个时期的片段挑10个去测序，结果分为大概分为两组相似度有差异的基因序列，每一组里各个序列之间有2-4个的差异或缺失，请问每个样都算一个基因吗？如果是的话基因片段序列最终怎么确定？dianaofyezi (站内联系TA)送去测序的是PCR产物还是克隆后产物？每组里面差异基因位置相同么？你测定的基因是否为保守基因呢？你测定的基因缺失是否在同一位置呢？thh2008 (站内联系TA)Originally posted by dianaofyezi at
1006:送去测序的是PCR产物还是克隆后产物？每组里面差异基因位置相同么？你测定的基因是否为保守基因呢？你测定的基因缺失是否在同一位置呢？是克隆后的菌液。位置有些相同，有些不同。是保守基因。缺失不在同一位置。谢谢！dianaofyezi (站内联系TA)如果是保守基因应该不会出现你说的突变和缺失这么多的情况。而且你的片段比较短测序出现这样的问题可能性也不会很大。我还是建议你好好找下PCR过程中的问题。因为出现突变和缺失的愿意最大的可能就是PCR过程和克隆过程了。另外你是做的不同时期的扩增，既然是保守基因不会因为在不同时期出现很大变化才对，否则怎么叫保守基因呢。xiajungang (站内联系TA)我也出现了这个问题。xiaoru2010 (站内联系TA)将其氨基酸序列进行比对，得出5个不同的基因（有一个氨基酸的差异就算），视为5个基因吧？陈思容 (站内联系TA)高保真 PCR，P完后直接送出去测序，
各位大大，本人将连到pMD-19 T载上并进行了测序（送的菌液），所得到的序列在进行时应该如何正确选择起始位点呢？我不明白为什么得到的序列里既没有T载的引物序列也没有之前扩增基因时所用到的引物序列呢。请高手指点，本人在此谢过barrey (站内联系TA)这个是不是有测序错误啊如果做了TA克隆的话,你用正向引物和反向引物的互补序列都能查找得到的啊在正向引物前面是ATTbarrey (站内联系TA)用VecScreen去载体序列,看看是不是载体自连的结果dianaofyezi (站内联系TA)在测序结果中式找不到引物的，这个很正常。如果你的序列是一个完整的ORF，你可以从ATG开始寻找。yujiaping1 (站内联系TA)找不到T载体的引物序列是正确的，但是如果找不到你用来克隆目的片段的引物，那么就存在问题了，但是我要强调的是找引物不是找和引物完全一致的序列，而是同样进行，和引物基本一致就可以。如果Blast还是找不到目的片段引物，那么所测的可能就是假阳性了。不知道楼主在送样之前是否检测阳性了呢？是用PCR检测的，还是用酶切检测的？hitliutao (站内联系TA)Originally posted by dianaofyezi at
1201:在测序结果中式找不到引物的，这个很正常。如果你的序列是一个完整的ORF，你可以从ATG开始寻找。PCR检测的,没有做酶切检测.由于测序是单向测序,所以应该找到的是正向引物以及反向引物的互补序列,请问我这么理解对不对:)hitliutao (站内联系TA)Originally posted by yujiaping1 at
1330:找不到T载体的引物序列是正确的，但是如果找不到你用来克隆目的片段的引物，那么就存在问题了，但是我要强调的是找引物不是找和引物完全一致的序列，而是同样进行，和引物基本一致就可以。如果Blast还是找不 ...PCR检测的,没有做酶切检测.由于测序是单向测序,所以应该找到的是正向引物以及反向引物的互补序列,请问我这么理解对不对yujiaping1 (站内联系TA)Originally posted by hitliutao at
1536:PCR检测的,没有做酶切检测.由于测序是单向测序,所以应该找到的是正向引物以及反向引物的互补序列,请问我这么理解对不对不一定是正向引物，有可能找到的就是反向引物，和正向引物的互补序列，克隆时正反向是有随机性的
因为Sanger测序的自动化应用限制，测序结果中是不可能出现引物序列的。只可能出现部分载体序列。但是如果使用的载体所推荐的测序引物，那测序结果中的载体序列一般不会太长，一般不影响BLAST结果。当然要是插入序列太短则可能在3‘端出现载体序列，与载体序列比对后直接手动删掉就好。 楼上说的vecscreen也确实还好用。
DNA测序过程可能遇到的问题及分析
对于一些生物测序公司（ 如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。为什么呢？
PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸 ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物（&600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。由于在测序的起始端总有一些碱基无法准确读出，因此，如果想得到PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。 PCR产物用T载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当在一条链上找不到引物序列时，可以在互补链上寻找引物序列。当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。 对测序引物的一般要求：1).特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；2).不能含有混合碱基；3).长度17-25碱基；4).纯度高，最好PAGE纯化；5).用ddH2O溶解，不要用TE/RTE溶解。质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于200bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此用于测序的PCR产物一般不低于200bp长度。其次，由于测序本身的限制，以一个100bp的PCR产物用于测序为例，去掉两个引物的序列大约40到50bp，再加上测序起始端的一些读不出的碱基，真正能够得到的有用序列不过30～40碱基，这是在最理想的条件下的假设，稍不顺利，测序就失败。因此，过短的PCR产物，只能克隆后进行测序。
此外，ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
测序自身再就是不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。 大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致凌乱峰。自己在割胶回收是要注意空离心要充分，不要带入酒精，这样防止造成酒精峰。仪器不要有灰尘，否则会出现钉子峰。还有测序模板要纯，对测序模板DNA的一般要求：1).DNA纯度要求高，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等，否则将有干扰峰；2).溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行，甚至无信号。鉴定时用1.2%琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加EB)，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等。也可以抽提的质粒DNA的不同构型，质粒DNA的3种构型是在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。
质粒大小可以用商品质粒Marker做标准，或自己的已知质粒做标准。提取质粒的试剂盒或割胶回收试剂盒会提供一个Elution Buffer给用户洗脱DNA，建议用户不要使用，因为其中含有的如EDTA等组分会对测序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败，就用ddH2O是最好的。DNA测序过程可能遇到的问题及分析/结束各位有相关经验的，包括从分子克隆到测序全过程经验的还望支持指点！flygocheng (站内联系TA)我在对DNA测序时,虽然在理论上不会出现引物峰,但是在靠近引物的片段还是会出现非常高,并且杂的波峰(与引物浓度有关).PCR产物需纯化才能测序,但是纯化试剂需要注意酒精的含量,过底则会导致引物后片段或者起始峰很低或者干脆没有.在测序过程中,对于POLYG/C片段,测序仪很有可能不能正确阅读,其后全是N,所以双向测序是必须的.虽然在说明书了提到了几种解决的方法,但是在实际操作中对结果的影响不大.本人也想请教,不知道谁还有什么好办法可以读过POLY G/C区的.johnsooh (站内联系TA)Poly G/C 由于其特殊的结构，使的在变性步骤出现困难，以至影响测序列的测通当然，如果用商业载体，一般使用的是单向测序引物PCR,但如果出现了结构或机器无法再读下去，就采用另一个克隆端，另一侧引物PCR，这样就增加了读通的机会！如果PolyG /C实在太多了，没办法就先在测序 PCR程序中增加变性时间，再采用双向PCR由于退火和延伸在一个反应温度下，所以没法更改该程序！谢谢支持stoni (站内联系TA)总结得非常好！望各位有实战经验的高手再补充一些ranger04 (站内联系TA)总结的很好，学习学习eleenjane (站内联系TA)很好很好！学习中！eleenjane (站内联系TA)既然版主让我说，我也就说些我的经验吧。我做的主要是第三代分子标记——单核苷酸多态性标记，要用到的实验技术包括PCR和测序。我实验室的测序仪型号是ABI-3100，将有PCR扩增条带的产物为模板，用3.2pmol浓度的测序引物（一般是单测，必要时是上下游同时测），以BigDye为荧光染料，先做一个测序PCR，反应的总体积是10Ul，反应完成后，加入81%酒精51ml，放入板式离心机中，4000rpm，30分钟，完成后将酒精离掉，待酒精味挥发完全后，加入Hi-Di10Ul，上PCR变性5分钟后，就可以直接上测序仪进行测序。在我们实验室，从来不会进行产物的纯化，所以我认为这是影响毛细管寿命的一个原因。最近在PCR和测序方面遇到很多困难，正在解决中啊！:)
Sample Text克隆一个基因测序结果后，上下游都在，但是翻译后发现，有好几处都有终止密码子，测序几次结果都是这样。不知道咋回事。求高手指点。。涕零感激。。在线等待。。。确定其实密码子是在第一个ATG哪儿吗？你的序列中有几个ATG呢。zemin_fang (站内联系TA)需要找对正确的读码框，建议用ORF finder寻找后再blast分析，找到与你需要的序列相似性最高的结果分析jqq1985 (站内联系TA)你的第三个阅读框式可以通读的。但是不是ATG其实罢了。可能1：如果是原核那就是片段不完整，缺了前面一部分。可能2：这是真核的基因，里面有内含子。真核需要从RNA 来获得cDNA序列。jqq1985 (站内联系TA)还有一种可能就是：你扩出来的做克隆的根本不是你要的东西。那个就要重新设计引物做了shuipan666 (站内联系TA)我引物就是从第一个ATG设计的，引物都对，就是测序后翻译不对。苦恼俄。shuipan666 (站内联系TA)另外和其他物种比对之后也正确...jqq1985 (站内联系TA)你的是真核还是原核的基因？另外有时候你还要反过来通读一下。应该把倒过来另外三种读法也读一下，如果你不确定正反的话shuipan666 (站内联系TA)是不是测序结果有问题俄。今天有让他们反向测序了。在等结果。谢谢好心人俄。。。yujiaping1 (站内联系TA)Originally posted by shuipan666 at
1232:我引物就是从第一个ATG设计的，引物都对，就是测序后翻译不对。苦恼俄。第一个ATG并不代表就是阅读框的开始，如楼上所说，要获得全序列后，使用ORFfinder，找到阅读框另外对测序结果不能完全信任，尤其有的时候有缺失或添加判读，会造成阅读框移码，这样就造成不该出现的终止子出现了。gdpn900 (站内联系TA)根据kozak规则判断一下你所认为的atg到底是不是起始密码子fungixx (站内联系TA)你到ncbi中blast一下 ，看看是不是你想要的。只有你的引物不代表什么。或者你的基因是从哪里得到的，真核的话 是cDNA吗。测序说句实话不可能错这么多 。。。。很可能不是你想要的建议测通，你是连接到T载体上了吗，那也有可能是测得是反向互补链。
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上海欧易生物医学科技有限公司成立于2010年5月，是在上海欧易生物科技有限公司（成立于2004年5月）的基础上，通过引进资金、人才，以及平台升级后快速发展起来的专业技术服务公司。公司立足生命科学，为临床与基础研究领域科学工作者提供分子生物学高端技术服务。
经过四年多的高速发展，公司已经形成生物芯片、深度测序两大核心服务体系。芯片服务以Affymetrix、Agilent两大领先技术平台为主，先后获得两家公司严格的服务资质认证，欧易目前已经挤身国内芯片服务主流供应商梯队。深度测序基于illumina公司hiseq 2500平台，经过三年的苦练内功，正蓄力待发。两大服务体系涵盖了基因组学、转录组学、表观基因组学和蛋白质组学等多个研究领域，为客户提供全面系统的解决方案。
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【求助】请教正向引物和反向引物测序的问题
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这个帖子发布于4年零232天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
现在我用做菌液PCR的检测引物去测序，得到的测序片段不包含引物片段，包括片段两端的载体序列，这是正常的，想请教的是如果进行blast对比，需不需要将测序结果进行互补序列的转化，测序公司给到的序列应该都是5'到3'的序列顺序吧？我用正向引物和反向引物测出来的去载体片段可以直接进行拼接和聚类吗？还是需要将正向引物测得的结果和反向引物测得的结果分别聚类拼接，将得到的contigs拿去进行Blast比对呢？或者将反向引物测得的序列进行反向互补的转换再拿去合正向的结果拼接聚类？这个方向问题有点儿晕，盼求解答，谢谢啦！
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测序是分正向测序和反向测序的。如果你是用反向引物测序的，那返回的结果相对于正向引物而言是反的。换句话说，如果正向引物测的是有义链，那么反向引物测的就是它的互补链。因此，反向引物的测序结果如果用软件进行blast，需要用测序结果的反向互补序列与靶序列进行比对。如果直接在NCBI中比对，就不用了，系统能自动识别正反向。如果你正向反向同时测了，（并且有重叠）那需要用反向结果的互补序列与正向结果去比对，找出重叠部分进行拼接。
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谢谢解答，你说NCBI可以自动识别正反向？也就是说我测序得到的序列直接拿去blast就可以吗，他可以自动比对该链的反向互补序列？如果我不知道我的哪个引物是正向哪个引物是反向，是不是应该按照载体序列从左到右的顺序进行比对？如果测序的结果进行同源比对的话是不是需要把相反方向的测序结果进行反向互补链的转换才可以和正向的测序结果进行比对呢？
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blast之后的结果里可以看到正向反向信息，如果你的序列是正向，那结果就是plus/plus,否则是反向序列
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amengjcm blast之后的结果里可以看到正向反向信息，如果你的序列是正向，那结果就是plus/plus,否则是反向序列原来是这样啊，那就只是反向，没有互补是吗？
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hello_silence 原来是这样啊，那就只是反向，没有互补是吗？互补？你的意思是比对上吧
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就是说blast比对的结果只是正反链的对比，没有进行反向互补的处理。。。另外，不同样品不同测序引物得到的去载体的结果可以直接进行seqman拼接得到contigs吗？
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如果样品同源性较高的话是可以用seqman拼接得到contigs的
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好吧，就是说只要是5‘到3’就可以，不用看正反向互补什么的对吧
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您好。我现在也在分析测序问题，和你一样用做菌液PCR的检测引物去测序，是正反引物都测序了的，得到目的片段大部分序列及插入位点两端的序列，想请教下，这样可以判断目的基因插入载体的方向吗？（做的事TA克隆的)
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PCR引物设计及评价
PCR引物设计及评价
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【实验目的】 1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。 2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。 【实验原理】 一、引物设计原则 聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计原则如下： 1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性； 2、引物的长度一般为15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应； 3、引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行； 4、引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大； 5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)； 6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 7、引物3'端不可修饰。引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。 8、引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加； 9、G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端 G值较低（绝对值不超过9），而5'端和中间 G值相对较高的引物。引物的3'端的 G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应； 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低，在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 二、引物设计软件Primer premier5.0及oligo6.0 &Premier&的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找。&Premier&还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列&朗读&、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。&Premier&可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mito-chondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 对引物进行分析评价的的软件中，&oligo& 是最著名的。它的使用并不十分复杂，Oligo 6.0的界面是三个图，Tm图、ΔG图和Frq图。&Oligo&的功能比&Premier&还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。所以引物设计的最佳搭配是&Premier&进行引物搜索&Oligo& 对引物分析评价。 【实验内容】 1、使用Primer premier5.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计。 2、使用oligo6.0对引物进行评价分析。 【实验方法】 一、引物搜索 1、打开Primer premier5.0软件，调入人瘦素 (leptin) 基因序列：点击&file&
&DNA sequence&；或者直接点击&file&
&DNA sequence&，弹出一对话框如下图，然后将序列人瘦素 (leptin) 基因复制在空白框。
2、序列文件显示如图，点击&Primer&；
3、进一步点击&search& 按钮，出现&search criteria&窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。我们将Product Size设置300－350，其他参数使用默 认值。
然后点击&OK& ，随之出现的Search Progress窗口中显示Search
Completed时，再点击&OK&。
4、这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
5、按照搜寻结果显示，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，逐条分析，依次筛选。下面进行序列筛选：点击其中一对引物，如第21#引物，在&Peimer Premier&主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由&None& 变成&Found& ，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有&Found&，只有&None& 。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
二、引物分析 1、打开oligo的页面如下：
2、单击file菜单再点open或点击&打开&快捷图标或者用快捷键&CTrl＋O&可弹出一对话框，然后选择序列人瘦素 (leptin) 基因。出现以下窗口。
3、点击&window&再点击&Tile&，出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标。 ?G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?G值在5'端和中间值比较高，而在3'端相对低（如图：） Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5'到3'的下降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq曲线为&Oligo 6&新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3'端Frq值相对较低的片段。
4、在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮 ，选好上游引物，此时该按钮变成红色，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。
5、当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。可以用&Analyse&菜单分析你的引物：比如有无引物二聚体、发卡结构等等。首先检查引物二聚体尤其是3'端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。
当我们结束以上三项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 【作业】 1、提交使用Primer premier5.0及oligo6.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计结果； 2、总结引物设计应注意的关键事项。
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