【求助】PCR条带太浅，试了很多原因都没有改进 - 经验共享 - 分析测试百科网 - 分析测试百科网
月度关注热点
【求助】PCR条带太浅，试了很多原因都没有改进
查看完整版本请点击这里：
PCR条带太浅，试了很多原因都没有改进。直接上图，求大神指教查看完整版本请点击这里：
hulu呼噜 ( 22:15:03)
还可以啊，不算很弱。你胶配的有问题，没溶解完全，染料多加点。
milkdog ( 22:15:28)
配胶的时候适当延长加热时间，增加PCR循环数，另外PCR产物直接跑胶，适当增加染料用量，拍胶图时适当调高光强度看看。
boom ( 22:15:59)
QUOTE:原帖由 standbyme 于
22:14 发表
1. 是不是你的胶染色不行啊，连marker都挺浅的，加大染料的用量试试。
2. 你PCR几个循环啊，加大循环数试试。
3. 你也可以直接拿PCR产物回收，用回收后的产物来做模板，继续PCR，这样特异性也会好一些。 ... 胶染色我延长了时间，但是mark亮了，条带还是不亮。pcr我都加到了40个循环，应该不少了吧。我现在主要的问题是：目标条带不亮，引物二聚体严重。我一共做了从54-59（引物TM一个是58，一个是59）度梯度pcr出来结果还是不行。好烦
boom ( 22:16:22)
QUOTE:原帖由 milkdog 于
22:15 发表
配胶的时候适当延长加热时间，增加PCR循环数，另外PCR产物直接跑胶，适当增加染料用量，拍胶图时适当调高光强度看看。 我用的是丙烯酰胺做的，我的循环数40个，我也跑过42个，但效果也不好。
boom ( 22:16:44)
QUOTE:原帖由 hulu呼噜 于
22:15 发表
还可以啊，不算很弱。你胶配的有问题，没溶解完全，染料多加点。
已经很暗了，基本上看不到带。我用的是丙烯酰胺胶做的，以前跑这么大片段都很亮的。
boom ( 22:17:16)
跑梯度的时候目标条带特别淡，二聚体特别严重。我真不知道该怎么办了
jiushikeshui371 ( 22:17:56)
兄弟，你二聚体严重就说明引物有问题啊，两条引物匹配比跟模板匹配还容易，不能换换引物了吗？
xevin ( 22:18:16)
感觉主要是你的胶有问题，条带都不整齐，还有点拖尾的现象
nikonun ( 22:18:43)
换引物吧，扩增效率不行
boom ( 22:19:24)
兄弟，你二聚体严重就说明引物有问题啊，两条引物匹配比跟模板匹配还容易，不能换换引物了吗？
------------------------------------------------------------------------------------------------------
老板出差去了，说回来文章都得写好。不会设计，今年刚研一。好急
boom ( 22:19:45)
QUOTE:原帖由 nikonun 于
22:18 发表
换引物吧，扩增效率不行 换引物是不可行了。老板要求十天做完，只有照一张较好的ps了
lagua123 ( 22:20:03)
胶有问题或者是凝胶成像仪没调好！
viviwang1987 ( 22:20:26)
染胶时溶液用EB的话可以直接加到微红（肉眼勉强可见），一般10分钟就可以。Marker也并不亮，说明染较并不很好。但是二聚体很多的话很可能是引物设计有问题，建议换引物。
我佛慈悲 ( 22:20:48)
引物问题，特异性差
tianmei001 ( 22:21:07)
温度，引物浓度，模板浓度
lagua123 ( 22:21:29)
引物二聚体太严重了
chengjie79 ( 22:22:01)
退火温度再升高点吧，试试62~65.我们有次引物浓度尝试到了68才能扩出来目的带。
sunbent ( 22:22:25)
试一下镁离子浓度看看
101010 ( 22:22:41)
可以换个胶板试试呀
估计能起作用
查看完整回复请点击这里：关注今日：8 | 主题：278631
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】PCR跑不出目的条带的原因
页码直达：
这个帖子发布于3年零181天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
各位大侠，请问下如下图所示，Marker最亮的是400BP，内参大小是107BP，没有问题，但是所有的目的基因都没有条带，并且阳性对照也没有条带，最右边的是换了其他组织及细胞跑的胶，同样没有目的条带，最下面的带都是引物二聚体吗，是因为引物有问题吗？急求高人解答，谢谢！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
先解决阳性对照再考虑你的目的基因。阳性对照都没有的可能性有两种，阳性对照模板有问题，pcr体系的问题（包括引物的问题）。看你的内参下面没有引物二聚体，那后面泳道里最下面的那一道就是引物二聚体了。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
pcr失败的原因太多了，试剂有问题，或者条件有问题，第一次用一个引物，建议做梯度
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
补充一下，退火 温度最好做一个梯度
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
退火温度调低一点试下，55℃
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
首先通常来说，你下面已经形成引物二聚体了，说明这个PCR酶是有活力的，然后你的阳性模板出不来，说明你的PCR设置的条件，比如模板到底有没有，模板的杂质会不会干扰你的实验，比如什么乱七八糟的蛋白啊，还有什么离子这类的，退火温度够不够高，引物设计是不是能够特异一点（google一下设计引物的原则就好） 延伸时间够不够，以及可以增加循环到35cycle，还有内参基因，可以的话，换一个大一点的P啦，100多bp都不知道是不是引物二聚体。。。。。确定好了，阳性可以P出来了，内参也可以了，再往下做才会比较顺利，祝你成功。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
退火温度是考虑的一个方面，可以考虑做一下预实验，确定一个比较好的退火温度。你所选择的试剂是否依旧有效，反复冻融会影响试剂。提取的DNA浓度够不够，或者说有没有提取出DNA引物的量是不是不够，引物是否选择正确
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
阳性对照没有说明你的目的基因没有P出来哎，你的DNA有没有？引物设计有没有问题？一般来讲反应条件的连接时间是不是短了？就是cycle里面72度的时间够不够，你用的是不是PFU酶。考虑完全了可以用TAQ酶做一个预实验。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我们之前做的也是，信心满满地跑胶了，结局只能看到一排引物带……最后的原因是：模板DNA浓度太低、量少，所以才没有扩出来，因为是RT-PCR，优化了提取RNA的条件，最后扩增跑胶再没出现过问题。你可以试试别人的模板，用别人的模板来检验一下你的反应体系、条件有木有问题，没问题的话，就可以往模板上找找看。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：8 | 主题：278631
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】普通PCR内参和目的
页码直达：
这个帖子发布于3年零147天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
普通PCR内参和目的，内参466bp，目的166bp，一起扩增的话怕引物之间存在竞争，且扩增条件也不同，我想知道能不能分开扩增，之后上样的时候加到一起跑，这样算不算是作假，可以么？
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
其实。。。。选的目的片段可以长一些会好一点。。。。不一定要按照文献来的，达到目的就可以了。166连是不是引物二聚体都难说。我觉得分开会比较好。同意你的说法。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
HR微生物 其实。。。。选的目的片段可以长一些会好一点。。。。不一定要按照文献来的，达到目的就可以了。166连是不是引物二聚体都难说。我觉得分开会比较好。同意你的说法。我的引物是公司设计的，166bp是公司给我搞的，太短的不好是么？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
大眼妹徐宁 我的引物是公司设计的，166bp是公司给我搞的，太短的不好是么？166也可以用的。好像大部分人都是分开扩增的。至少我知道的都是分开扩增的，所以分开扩增肯定没问题的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
如版主所言，先试试吧，但是我还是觉得可以长一些，公司设计的不是理由啊。。。完全可以自己设计。。。具体的优化要看你的实验目的才能够确定。祝你好运啦。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
reyesa 166也可以用的。好像大部分人都是分开扩增的。至少我知道的都是分开扩增的，所以分开扩增肯定没问题的分开扩增，一起跑（一个孔里同时加内参的扩增产物和目的基因扩增产物）；还是分开扩增，分开跑？（两个孔分开跑）。我老板是说让我一起跑，内参和目的在一个泳道里同时表现出来。我该肿么办呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不行的哦，内参的目的是确定你这个体系没问题，确定你不是假阳性，是一起扩增，自然是一起跑
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
HR微生物 如版主所言，先试试吧，但是我还是觉得可以长一些，公司设计的不是理由啊。。。完全可以自己设计。。。具体的优化要看你的实验目的才能够确定。祝你好运啦。我不会自己设计啊，而且实验室有人说自己设计的精准的也不见得结果好么。。。。。。。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
reyesa 166也可以用的。好像大部分人都是分开扩增的。至少我知道的都是分开扩增的，所以分开扩增肯定没问题的分开扩增的话，怎样做对比呢？我看有的说量化因子，量化因子是个什么概念？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
馨露涩美 不行的哦，内参的目的是确定你这个体系没问题，确定你不是假阳性，是一起扩增，自然是一起跑你是一起扩增，一起跑的吗？这个退火温度，扩增次数该怎么控制呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
大眼妹徐宁 你是一起扩增，一起跑的吗？这个退火温度，扩增次数该怎么控制呢？是的，扩增次数就是一样的30~35次，退火温度我就取个靠近的，我的引物tm差不多的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
馨露涩美 是的，扩增次数就是一样的30~35次，退火温度我就取个靠近的，我的引物tm差不多的对哦，可以让公司设计的退火温度差不多的引物。是不是bp越大的话到达平台期的所用的扩增时间久越长。怎样能确保内参466bp和目的166bp刚好扩增在对数期之内？我要提前分开跑试一下，摸索一下，然后在一起跑吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
大眼妹徐宁 对哦，可以让公司设计的退火温度差不多的引物。是不是bp越大的话到达平台期的所用的扩增时间久越长。怎样能确保内参466bp和目的166bp刚好扩增在对数期之内？我要提前分开跑试一下，摸索一下，然后在一起跑吗？其实不用，说是那样说，用的时间多少，其实影响没有那么大，你都重新设计了，可以考虑设计个差距在200bp内的条带啊！你可以先试下一起跑，应该没什么问题
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
大眼妹徐宁 对哦，可以让公司设计的退火温度差不多的引物。是不是bp越大的话到达平台期的所用的扩增时间久越长。怎样能确保内参466bp和目的166bp刚好扩增在对数期之内？我要提前分开跑试一下，摸索一下，然后在一起跑吗？ 不存在bp越大所用时间越长这种理由，，RT-PCR的定量条件控制要严谨一些，不然定量结果没有意义。。建议做分开的，因为内参和目的所需循环数基本是不一样的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
大眼妹徐宁 分开扩增的话，怎样做对比呢？我看有的说量化因子，量化因子是个什么概念？很多退火温度不同的引物都是要分开扩增的。这样的体系默认内标的作用只是比较模板上样量当然比较粗略，但一般情况下也是可信的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
因为内参和目的所需循环数基本是不一样的循环次数不一样，但是内参和目的都确定在扩增的对数期范围内，这样可以吗？不同组之间的内参都是扩增相同的循环，而且都在对数期范围内。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
馨露涩美 差距在200bp内的条带啊！你可以先试下一起跑，应该没什么问题就是说，内参和目的的大小差距要在100-200bp之间，这样一起跑不仅能跑开，而且扩增时循环次数也不会差很多，是不？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
大眼妹徐宁 就是说，内参和目的的大小差距要在100-200bp之间，这样一起跑不仅能跑开，而且扩增时循环次数也不会差很多，是不？，就是这个意思，嘿嘿，因为差距太大的我没有跑过，100~200我跑过，非常容易出结果，而且非常稳定
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园