摘要 : 日，国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Communications》杂志在线发表了上海交通大学医学院健康科学研究所胡国宏研究组题为“MicroRNA-182 Targets SMAD7 to Potentiate TGFβ-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis of Cancer Cells”的最新研究成果。
&日，国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature
Communications》杂志在线发表了上海交通大学医学院健康科学研究所胡国宏研究组题为&MicroRNA-182 Targets SMAD7 to
Potentiate TGF&-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition and metastasis of
Cancer Cells&的最新研究成果。研究论文揭示了microRNA-182
(miR-182)在肿瘤细胞对TGF&应答过程中的调控作用。博士研究生余静宜，雷蓉等为论文第一作者，胡国宏研究员为论文通讯作者。
转化生长因子(TGF&)在生物发育过程中有非常重要的作用，而在肿瘤转移中，TGF&引起肿瘤细胞的上皮-间充质转化和侵袭转移。尤其是在乳腺癌的骨转移中，TGF&信号介导了癌细胞与骨微环境的相互作用，癌细胞中TGF&信号的持续过度激活对转移灶的形成非常关键。在正常细胞中，细胞可通过激活抑制性SMAD蛋白SMAD7实现对TGF&的负反馈调节，但在癌细胞中可能存在着这种负反馈调节的失控，而这种失控可能是肿瘤进展和转移的重要特点。因此，揭示肿瘤细胞对应答TGF&过程中的调控机制的研究显得十分重要。
博士研究生余静宜、雷蓉等研究发现TGF&可以促进肿瘤细胞miR-182的转录，而miR-182通过靶向抑制SMAD7的翻译从而阻断对TGF&的负反馈调节，引起肿瘤细胞TGF&的持续增强，促进TGF&引起的癌细胞上皮-间充质转化及肿瘤侵袭，以及在骨中肿瘤-破骨细胞的互作和骨转移灶形成。
研究发现了肿瘤骨转移过程中重要的调控因子miR-182，确定了miR-182通过抑制靶SMAD7促进肿瘤细胞对TGF&的响应，进一步阐明了肿瘤转移过程中关键的TGF&信号通路的调控机制，也提示了miR-182有可能成为临床上解决肿瘤转移的一个新的重要靶点。
TGF&可以促进肿瘤细胞miR-182的转录，而miR-182通过靶向抑制SMAD7的翻译阻断对TGF&的负反馈调节，引起肿瘤细胞TGF&的持续增强，促进TGF&引起的癌细胞上皮-间充质转化及肿瘤侵袭，以及在骨中肿瘤-破骨细胞的互作和骨转移灶形成
原文链接：
原文摘要：
The transforming growth factor & (TGF&) pathway plays critical roles during
cancer cell epithelial-mesenchymal transition (EMT) and metastasis. SMAD7 is
both a transcriptional target and a negative regulator of TGF& signalling, thus
mediating a negative feedback loop that may potentially restrain TGF& responses
of cancer cells. Here, however, we show that TGF& treatment induces SMAD7
transcription but not its protein level in a panel of cancer cells. Mechanistic
studies reveal that TGF& activates the expression of microRNA-182 (miR-182),
which suppresses SMAD7 protein. miR-182 silencing leads to SMAD7 upregulation on
TGF& treatment and prevents TGF&-induced EMT and invasion of cancer cells.
Overexpression of miR-182 promotes breast tumour invasion and TGF&-induced
osteoclastogenesis for bone metastasis. Furthermore, miR-182 expression
inversely correlates with SMAD7 protein in human tumour samples. Therefore, our
data reveal the miR-182-mediated disruption of TGF& self-restraint and provide a
mechanism to explain the unleashed TGF& responses in metastatic cancer
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增值电信业务经营许可证:粤B2-(C) 生物帮 All rights reserved.2004cell上microRNA综述文章精要翻译（上）
&&& microRNA是一种广泛存在于动植物中的内源性的RNA，约22个碱基。 microRNA主要通过抑制翻译和切割mRNA来达到快速调控基因表达的目的。发表于2004年cell的一篇综述很好的介绍了microRNA的基因组学特点，生物学发生，调控机制和功能。
&&& 人们最初发现microRNA是在研究线虫幼虫发育的时候，观察到一种小RNA片段，这种RNA片段不负责携带蛋白的翻译信息，反而可以互补性的结合在mRNA的3&UTR上介导翻译的抑制。
&&& 在整个基因组上，大部分microRNA是分散存在，说明它们源于独立的转录单元；另有不少的microRNA多是分布于基因的内含子中，并且随基因的转录而转录的，microRNA鲜有自己独立的启动子；还有一种microRNA是以cluster的形式存在的，往往功能相关。但总的来说功能相关的却不一定成簇存在，且序列上不一定有相似。在不同种的远近源动物之间，microRNA的结构是相当保守的。在不同的发育时期和不同类型的细胞中，microRNA的表达谱是不同的，不同的microRNA在某一细胞中的绝对量还是差异很大的。通过实验手段搜索microRNA有时间和技术上的困难，于是使用计算机手段通过搜索同源microRNA就有着实际意义。另外一个搜索方法是在已知的microRNA附近寻找茎环节构。除此之外，还有一种方法，在基因组上搜索编码蛋白区域之外的含茎环节构的序列，通过比较已知的microRNA来为其打分。目前已有软件提供：MiRscan和miRseeker。但近来的发现指出人类的许多难于克隆的microRNA在鱼类中并无相似的microRNA存在提示上面提到的软件搜索方式存在缺陷。
&&& 植物和动物的microRNA有着相似之处，多数调节基因表达的都是由microRNA完成的。但它们的生物学功能有着差异。这种同中有异的现象说明植物和动物在共同祖先时代就已有microRNA的存在，但在两者分离之后，各自细胞内的microRNA进行着互不相干的进化过程。
&&& 多种证据表明microRNA是由polII转录出来的。但也有显示polIII也可以转录microRNA。microRNA是以前体的形式被转录的。这个前体是60-70nt的茎环结构，叫pre-microRNA，之后被Drosha切断双链，形成5&磷酸和3&2-3个nt的侧翼序列，并被转运到胞质中，由Dicer在另一端切割形成同样的5&磷酸和3&2-3个nt的侧翼序列。在植物细胞中均由DCL在核内切割pre-miRNA。此时的miRNA:miRNA*是瞬时存在，很快miRNA*被降解，miRNA与RISC形成复合物行使功能。
&&最后修改于
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题名: microRNA 在灵长类中的进化及其对靶基因表达变异度的影响;
MicroRNA Evolution in Primates and Its Impact on Target Expression Variability
学位类别: 博士
授予单位: 中国科学院研究生院
授予地点: 北京
其他题名: MicroRNA Evolution in Primates and Its Impact on Target Expression Variability
中文摘要: microRNAs（miRNAs）是基因组中广泛编码的一类小RNA 基因，存在于绝大多数多细胞生物中，而且在各种生物学过程中都起着举足轻重的作用。miRNAs 在转录后水平通过与mRNAs 的3’UTRs 序列互补识别靶基因，并引起靶基因的降解或阻遏其翻译。在动物中，一个miRNA 可以调控数百个靶基因的表达。大多数miRNAs 在物种间高度保守，暗示了其功能的重要性。然而，非保守的miRNAs可能对物种特有新功能的产生有贡献。为了回答miRNAs是如何起源，如何进化的问题，我们研究了两个非保守miRNA 家族在灵长类中的进化历史。第一个miRNA 家族位于X 染色体上，在灵长类中的数目比狗或啮齿类中的多。我们比较了这一家族在灵长类主要分支－人、大猿、小猿、旧大陆猴和新大陆猴中的序列情况，发现了这一家族在灵长类中的快速进化。这种快速进化包括频繁的串联重复和碱基替换现象。此外，在人和黑猩猩中还发现了相应进化分支特有的替换，可能会导致分支特有的新miRNAs 的产生。对这一miRNA 家族在不同发育阶段恒河猴睾丸中的表达分析揭示了miRNA 表达变化和雄性性成熟之间的负相关，暗示这一家族在睾丸发育和精子成熟中可能起的调节作用。最后，我们认为，像蛋白编码基因一样，与雄性生殖功能相关的miRNAs 容易受到性选择而发生适应性进化。第二个miRNA 家族是位于19 号染色体上的一个灵长类特有的家族。通过分析和比较这一家族以及其临近区域在9 个不同灵长类物种中的序列，我们发现了 Alu 介导的这一家族的产生和扩张。序列比较表明，物种内和物种间miRNAs 的序列分歧相似；同时，在各个灵长类分支中均存在基因拷贝的获得和丢失，也存在基因的假基因化。由此表明，这一家族在灵长类中经历了典型的“生－死”进化历程，暗示这个家族的miRNA 基因在灵长类的进化中其功能可能发生了多样化，以适应不同灵长类物种在发育过程中的需要。此外，二级结构的保守性和前体miRNAs 区域的低SNP 密度都表明这一家族受到功能性约束。最后，我们进一步分析了这一家族在胎盘和胎儿大脑中的表达，揭示其对灵长类胚胎发育可能的重要性。除了研究miRNAs 在灵长类中的进化，我们还探讨了miRNAs 对基因表达变异度的影响。通过对已发表的193 例人类大脑基因表达谱的分析发现，基因在人群中的表达变异的大小和调控它的miRNA 数目呈正比，这暗示了miRNAs 对基因表达变异度的直接影响。相比于不受miRNA 调控的基因，受到两个以上 miRNA 核心区调控的基因有较高的表达变异度，不受miRNA 类型的影响。同时，我们还证明，人群中靶基因miRNA 识别序列上的变异（SNPs）会进一步导致靶基因表达变异的增加。我们的研究表明miRNAs 是影响人群中基因表达变异度的因素之一。
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张锐.microRNA 在灵长类中的进化及其对靶基因表达变异度的影响[博士].北京.中国科学院研究生院.2009
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基于microRNA调控网络的癌症药物筛选系统及其药物基因组学应用
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寄生虫microRNA的研究方法
548中国兽医科学第40卷
生虫miRNA提供参考。型或功能的差异筛选小RNA,不过小干扰RNA文库在寄生虫方面的报道很少。与此相反,Northern?blotting、Real?timePCR方法、miRNA微芯片技术等均大量应用于筛选和鉴定寄生虫miRNA。在寄生虫miRNA研究中主要使用改进的Real?timePCR方法(stem?loopRT?PCR)。该方法在常规Real?timePCR引物对的基础上增加了一个环状引物,用于提高扩增的特异性[20]。Stem?loopRT?PCR单独或与Northern?blotting联用,是最为常见的定量检测寄生虫中某种miRNA的方法。miRNA微芯片技术则尤其适用于不同发育期miRNA种类和数量差异的高通量分析,并可以同时定量miRNA,但不足之处是信息质量的稳定性较差,重复性较低,所以miRNA芯片分析之后获得的结果通常要用Northern?blotting或Real?timePCR进行进一步验证。cDNA文库法是在获得的小片段RNA两端添加接头,反转录后与载体进行连接及转化,然后提取质粒进行测序。其优点是测序质量稳定,目标序列易于保存,但是要预先构建cDNA文库,受到建库容量及测序的限制,工作量大,效率较低,比较适合于小规模miRNA检测。
??与遗传学方法相比,分子生物学方法较好地解决了miRNA高通量分析和验证问题。但是在寄生虫中有些miRNA表达水平很低而且其生活史也决定了不同发育阶段的表达特异性,这类miRNA的基因很难用遗传学方法及上述分子生物学方法进行研究,高通量测序和生物信息学分析相结合的方法比较好地解决了这个问题。
1?经典遗传学方法
??经典遗传学方法包括正向遗传学和反向遗传学两个方面,目前在植物和动物中应用较多,在寄生虫研究中应用较少。正向遗传学研究首先通过突变手段获得目标生物的突变个体,然后对正常和突变个体基因进行扩增比对,获得目标基因的调控情况;反向遗传学则是通过定点诱变等方式通过构建外源基因进行基因突变,然后通过表型的改变探讨基因的功能。最早发现的lin?4基因就是通过正向遗传学方法在对与寄生线虫比较接近的秀丽新杆线虫(Caenorhabditiselegans)进行研究时发现的。通过类似的方法,Reinhart等[16]在秀丽新杆线虫中发现了第二个miRNA,称为let?7,其长度也为22nt,参与lin?41和hbl?1基因的转录后抑制。而线虫mir273则是采用了反向遗传学方法揭示的[1]。??经典遗传学方法为miRNA基因调控研究打开了通道。但其不足之处也很明显:首先是经典遗传学的不确定性。根据现在对miRNA的了解,miR?NA存在一个第2到第9个碱基的种子区(seedre?gion)[17?18],种子区之外的碱基突变在一定程度上并不影响miRNA的功能,这将导致部分miRNA的突变不能被发现。其次,经典遗传学研究通量较低,对于某一个具体物种丰富的miRNA种类缺乏高通量研究的能力,此后发展起来的分子生物学及生物信息学方法则填补了经典遗传学方法的缺陷。
2?分子生物学方法
??分子生物学方法包括小干扰RNA文库法(RNAi文库)、cDNA文库法、RNA印迹法(Northern?blotting)[11?12]、Real?timePCR方法[14,20]、miRNA微芯片技术[21?22]、RAKEassay分析技术及原位杂交技术等。各种分子生物学方法基本都要求制备较高质量的总RNA及对总RNA进行大小分级获得miRNA级别范围(18~25nt)的smallRNA(sRNA)。其中总RNA的获得通常采用Trizol裂解的方法,而非采用过柱的方式,以确保小RNA不受损失。各种具体的RNA制备及前期处理方法虽然彼此有些差异,但基本原理和操作方法是一致的说明。
3?高通量测序与生物信息学分析方法
??随着高通量测序技术的发展,近来的直接克隆法采取添加接头及反转录后直接测序,避免了文库构建,无需载体连接。其优点在于快速和高通量,获得的片段数量(reads)通常可以达到millions级别,基本包含了样本中全部miRNA信息,非常适合于寄生虫某个发育时期及不同发育阶段miRNA表达谱的分析,尤其是低丰度miRNA的分析。生物信息学方法应用于寄生虫miRNA分析主要包括两部分内容:即高通量测序获得的数据前期处理、后期预测方面以及利用已有的数据库信息预测新的miRNA及其靶位点。
3.1?高通量测序数据的生物信息学处理
??测序数据的前期处理包括去除3?adaptor,3??5?空载体等污染片段,然后通过与该寄生虫基因组,可参阅相关文献及操作
??小干扰RNA文库法比较接近于反向遗传学方法,通过人工设计的可抑制众多不同基因表达的小,
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