质粒转染进细胞后，能整合进基因组吗，关于RNA干扰(基因组,质粒转染,病毒) - DNA技术 - 生物秀
标题: 质粒转染进细胞后，能整合进基因组吗，关于RNA干扰(基因组,质粒转染,病毒)
摘要: [质粒转染进细胞后，能整合进基因组吗，关于RNA干扰(基因组,质粒转染,病毒)] 急呀，好象只能用病毒吧，大家有没有听说过，如果没有整合进去，那么干扰的周期又有多长？超急！！！！！听说是几周，有没有具体点的啊？？？奇急！！！！！！！ 关键词:[基因组 质粒转染 病毒]……
急呀，好象只能用病毒吧，大家有没有听说过，如果没有整合进去，那么干扰的周期又有多长？超急！！！！！听说是几周，有没有具体点的啊？？？奇急！！！！！！！
回复高手都到哪里去了,求教求教呀回复可能有部分整合进去，但通常看的是瞬时转染的效果。我们实验室做的，转染后三到四天RNAi的效果比较好。如果你要整合进基因组的RNAi的细胞，那就是建细胞系了，要用G418杀细胞，筛选克隆，然后得到一个克隆的RNAi的细胞，再用来做实验，需要一定的时间和技术不知道你指的是不是这个意思回复可能有部分整合进去，但通常看的是瞬时转染的效果。我们实验室做的，转染后三到四天RNAi的效果比较好。如果你要整合进基因组的RNAi的细胞，那就是建细胞系了，要用G418杀细胞，筛选克隆，然后得到一个克隆的RNAi的细胞，再用来做实验，需要一定的时间和技术不知道你指的是不是这个意思得到很多信息了，但是整合的机理是什么呢，重组？回复我觉得是重组吧，没有具体研究过：）回复质粒进入细胞后有两中命运,一是独立于染色体而存在,可以支持一阵子,到后面还是会丢失.这就是常说的瞬时转染. 效果不能长久.另外一种是整合到染色体上去,找个婆家,在那里呆下来,可以传宗接代,形成稳定的细胞系.如果需要,你要加药物筛选,来挑取单克隆.这叫稳定转化,象基因打靶就是这玩意.你如果要做长期效果,最好用整合的方法,要求DNA在转化前先线性化,这样可以提高20倍整合效果.具体原理去看看书,回复谢楼上的
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电话：021-贴壁细胞传代后第几天可以换液(贴壁细胞,传代) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 贴壁细胞传代后第几天可以换液(贴壁细胞,传代)
摘要: [贴壁细胞传代后第几天可以换液(贴壁细胞,传代)] 请问贴壁细胞系传代后第几天可以换液 关键词:[贴壁细胞 传代]……
请问贴壁细胞系传代后第几天可以换液
回复大概3~4天换一次液，我用的是MEM培养基，其实你可以通过培养基的颜色来判断的。当培养基的颜色由红色渐渐褪成黄色，说明细胞在生长过程中排出的废物使培养基变酸了，这个时候就该换液，不然变酸的培养基会影响细胞的生长，使细胞变圆、脱落。回复传代之后短期内需要把死细胞去除吗？回复传代之后将死细胞去除有助于活细胞的贴壁及生长，因为细胞死亡后释放出来的内源性毒性物质 如等将影响正常细胞的生长。当然这也有量的问题，如果死亡细胞数目不多，基本上对细胞的生长没有明显的影响，但是如果特别多 最好等细胞贴壁后通过换液加以除去。这一点对于转染细胞的初次传代特别重要回复一般贴壁细胞在4小时以后开始贴壁，这时候最好不要进行换液等操作。在细胞完全贴壁以后，再用PBS缓冲液进行冲洗，换液。回复多谢各位指点，受益颇深回复三个问题请教一下:1.传代换液时,把没贴壁的细胞重新接种,能贴壁生长吗?2.每次换液都需要用pbs洗吗?3.有两种换液方式:去一半换一半和全去全换.请问,去一半换一半是用于什么时候,细胞维持生长的时候吗?回复楼上的问题：1。如果你的细胞是贴壁的，在你换液时，仍没有贴的，考虑下是否是已死亡的细胞。2。没必要。3。这个我也不知道，等待达人。回复换液方式:去一半换一半是为了细胞逐步适应新培养液,避免细胞外环境大的变化,特别对于原代培养的细胞来说比较重要.随着细胞的生长,培养液中细胞自身的代谢产物会累积,这就需要通过换液去除,但是作为群体生长的细胞他们之间也会释放有助于生长的物质到培养液中,这就要求我们换液是采取半量换液的方法.既可以除去代谢产物又可以保留适量的促生长物质,同时避免了外环境的大波动.这对于原代培养特别重要.回复谢谢楼上两位的解答,让我受益不小.回复如果是贴壁细胞,不需要用pbs洗涤．直接倒去一半培养基在加新的培养基就可以了．回复不一定每次换液的时候都要用pbs洗的，因为用pbs洗的作用主要是为了洗到，免得在接下来用胰酶消化的时候，的残留会影响胰酶的作用，如果只是换液，并不传代，不用pbs洗也行的
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RNA干扰及其应用进展
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RNA干扰及其应用进展
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生物化学和分子生物学进展 课程论文 RNA 干扰技术的研究进展 术研究进展姓名：孙华润 专业：基础兽医学 学号： 导师：胡功政 时间：
RNA 干扰技术的研究进展孙华润（2015 届基础兽医班）摘要： RNA 干扰(RNA interference， RNAi
)是指细胞利用外源性或内源性小干扰 RNA 激发相关的酶复合物， 对同源性 mRNA 进行切割、降解，从而在转录后水平阻断基因表达，达到同源基因的减效表达或不表达的 过程，是一新兴的基因阻断技术。RNAi 在基因组功能研究和病毒性、遗传性疾病以及肿瘤等多种疾病的治 疗中具有广阔的应用前景。本文就近期国内外在该领域的研究动态分别从 RNA 干扰机制、重要特征、临床 应用加以简述。 关键词：RNAi；RNA 干扰机制；重要特征；临床应用The Research Progress of RNA InterferenceSUN Hua-run(Class of Basic veterinary in 2015）Abstract:RNA interference is a new technology of gene block that cell using the exogenous or endogenous small RNA to inspire the relevant enzyme complex to cut,and degrade the homologous mRNA so that the transcription level block gene expression to achieve a milder expression of homologous gene express process or not.RNAi has a broad application prospect to treat the disease in genomic functional research , viral,hereditary and dancer . This paper sketches about the domestic and foreign research dynamics from RNA interference mechanism,important characteristic and clinic applications. Key words:RNAi；RNA interference；important characteristic； clinic applications.RNA 干扰技术被《科学》杂志评为 2002 年世界十大科学进展之首，两名美国发现者获 得了 2006 年度诺贝尔医学奖。 RNAi 在线虫、 果蝇体内甚至能达到基因敲除的效果， 利用 RNAi 技术在小鼠和人的体外培养细胞中也成功阻断了基因的表达，实现了细胞水平的基因敲除。 无论在基础研究领域，还是在医学应用领域，RNAi 都是一种不可多得的有力工具。随着对 RNAi 分子机制的深入研究及其技术的不断成熟和发展，RNAi 将对医学、生物学的发展产生 [1] 深远影响 。1 RNAi 的发现和原理早在 1990 年，生物科学家就在植物中发现了 RNAi 现象[2,3]。科学家认为这是植物细胞 防御环境伤害的过程中由双链 RNA 区域来区别和对抗病毒以及不稳定的染色体的生物现 象． 其机制被认为是一种转基因调控的抗病毒以及病毒诱导基因沉默或转录后基因沉默的途 径。直到 1998 年，华盛顿卡耐基研究院 Andrew Fire 和麻州大学医学院 Craig Mello 将纯化 的双链 RNA 注射到线虫时发现其基因抑制效果十分明显而且特异，并作了专题报道[4]。该 研究组将这一现象称为 RNAi。随后的几年中，在许多真核生物中都发现存在 RNAi 现象[5]。这提示 RNAi 在生命进化 的早期阶段就可能存在。由于长于 30 bp 的双链 RNA 导人哺乳动物细胞内会引起非特异反 应，如干扰素反应，因此哺乳动物基因特异沉默研究应用受到限制。在 2001 年，Tuschl 等 人发现 21~25 bp 的双链 RNA 可用于哺乳动物基因特异沉默[6]。这项发现把 RNAi 研究推向 高潮，同时也使 RNAi 作为基因功能研究的有力工具越来越为人们所重视。2RNAi 的干扰机制RNA 干扰广泛存在于真菌，植物、无脊椎动物和哺乳功物的各种生物体中。现在人们 意识到这种现象之间存在着密切联系， 可能在生物体内有着共同的生物学意义和相似的作用 [7] 机制 。 RNAi 作为一种新的基因阻断技术，具有特异、高效的基因沉默效应，高效地阻抑特定 基因的表达，现已广泛用于抗肿瘤、抗病毒的基因治疗研究。虽然 RNAi 的确切机制尚未完 全清楚，但目前大量的研究表明 RNAi 主要以转录后基因沉默的方式对其同原 mRNA 的表 达进行干涉。最近的研究提示 dsRNA 介导的 DNA 甲基化也是 RN Ai 的一种机制。近来， 利用线虫、 果蝇、 斑马鱼等生物进行的研究使人们对 RNAi 机制的阐明日益深入。 目前认为， RNAi 机制包括以下阶段。 1 起始阶段 RNA 酶Ⅲ家族成员之一的 Dicer 酶能以 ATP 依赖方式切割由外源导人或者 由转基因、病毒感染、转座子的转录产物等各种方式引人的 dsRNA。在 Dicer 酶作用下， dsRNA 被降解为 21~23 碱基的小干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)小片段，最终导 致病毒被清除，基因表达被阻断。研究者认为 dsRNA 降解成 siRNA 的原因可能为：(1)增加 细胞内 siRNA 浓度，使其在组织、器官间更有效地扩散；(2)通过将 dsRNA 降解成 siRNA 片段能不可逆地切断病毒基因组，从而排除任何 RNAi 效应可能引发病毒播散的可能性； (3)dsRNA 降解成 21~23 nt 为同源搜索机制提供最佳特异性。 2 效 应 阶 段 siRNA 双 链 与 单 个 核 酶 复 合 物 形 成 RNA 诱 导 活 化 沉 默 的 复 合 物 (RNA． inducedsilencing complex， RISC)。 被激活的 RISC 可通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上，并在距离 siRNA3’端 12 个碱基的位置切割 mRNA。有人提出在 RNAi 途径中可 能存在信号扩增系统。通过该系统可能是扩增复制外源注入的 dsRNA，也可能是直接扩增 siRNA 本 身， 从而 产生更 多的 siRNA 。在 以 RNA 为模 板指导 RNA 合 成的 聚合 酶 (RNA-Dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，进入细胞内的 dsRNA 通过类似于 PCR 反 应过程，呈指数级数量扩增。这种扩增可能在 RISC 形成过程中迸行，作为 RISC 形成的补 充，或者独立于 RISC 进行[8]。该假设的依据是在一些生物体细胞内存在 RdRP 的现象。研 究表明， siRNA 是 2l~25 nt 的短双链， 3’为羟基末端且有两个不配对核苷酸， 5’磷酸化。 SiRNA 可能必须以该结构形式进入蛋白复合体。 不同的 siRNA 长度可能反应了物种之间 Dicer 同源 蛋白的空间和结构的不同。综上，RNAi 过程可以简单描述为：双链 RNA 进入细胞后，在 Dicer 作用下，被裂解成 21 到 23 个核苷酸的 siRNA，从而启动了细胞内 RNAi 反应。随后 siRNA 双链结构被解开成为单链，并和某些蛋白形成复合物。此复合物同与 siRNA 互补的 mRNA 结合，使 mRNA 被 RNA 酶降解。 综上，RNAi 过程可以简单描述为：双链 RNA 进入细胞后，在 Dicer 作用下，被裂解成 21 到 23 个核苷酸的 siRNA，从而启动了细胞内 RNAi 反应。 随后 siRNA 双链结构被解开成 为单链，并和某些蛋白形成复合物。此复合物同与 siRNA 互补的 mRNA 结合，使 mRNA 被 RNA 酶降解。3RNAi 的重要特征(1)RNAi 是转录后基因沉默 PTGS 机制， 采用该基因的内含子或者启动子顺序的 dsRNA都没有干涉效应。翻译抑制剂对 RNAi 不产生影响。(2)RNAi 能够非常特异地降解与之序列 相应的单个内源基因的 mRNA，即 RNAi 具有较高的特异性。RNAi 高效率抑制基因表达是 以催化放大的方式进行的，相对很少量的 dsRNA(远远少于内源 mRNA 的数量)就可以使表 型达到缺失突变体的程度。但产生高效的干扰效应需要一个最小长度(21~23 nt)的 dsRNA。 如果 dsRNA 片段小于上述长度，如 10~15 nt，特异性将显著降低，不能保证与细胞内非靶 向基因不产生相互作用，如远远大于 21~23 nt，互补序列可能延伸，可能导致不能在哺乳动 物中诱导特异的 RNAi，而引起细胞非特异性和全面基因表达受抑制及凋亡。(3)RNA 干扰 效应呈浓度、 时间双重依赖性。 干扰效应多出现在注射 dsRNA 6h 后， 效应可持续 72 h 以上。 (4)RNAi 抑制基因表达的效应可以越过细胞界限在不同细胞甚至生物体之间传递和维持， 并 可传递给子一代。(5)RNAi 是 ATP 依赖的样品中去除 ATP 后，RNA 干扰效应降低或消失， 提示 RNA 干扰是 ATP 依赖的。目前认为可能 Diecer 和 RISC 催化的酶切反应必须由 ATP 提供能量。(6)RNAi 具有很高的特异性，能够非常特异性地降解与之序列相应的内源基因的 mRNA；(7)RNAi 抑制基因表达具有很高的教率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而 且相对很少量的双链 RNA 分子(数量远远少于内源 mRNA 的数量)就能完全抑制相应基因的 表达； (8)RNAi 抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限， 在不同细胞间长距离传递和维持[9]； (9)有剂量依赖关系；(10)可以有教地与其他较成熟的基因功能研究方法结合使用。4 RNAi 技术与以往的反义核昔酸技术的不同点两种技术有两个重要区别：一是反义棱苷酸技术所用的寡核苷酸链的长度并无特定限 制，而 RNAi 技术所用的寡核苷酸片段均为 21~23bp；二是反义核苷酸技术的基因沉默来源 于特定寡棱苷酸对靶序列的封闭作用， 无酶切作用[10]， 而 RNAi 技术则是利用特定长度的寡 核苷酸先与酶蛋白形成复合体， 然后利用互补识别过程与靶序列结合， 再由酶蛋白对靶序列 离 3‘端 12bp 处发生酶切作用。5 RNAi 的意义和应用目前认为自然界动、植物等生物中存在 RNAi 的意义在于：RNAi 在动、植物中作为基因组 免疫系统(genome immune system)而有效防止外源有害基因如病毒的侵人，同时 RNAi 也是 基因表达调控的重要途径之一。RNAi 技术在生命科学研究中具有及其广泛的应用前景。 （1）基因研究 酵母杂交系、DNA 芯片、基因敲除、反义 RNA 等技术的建立和完善， 为解读基因功能提供了有效的研究手段。 后基因组时代要求大规模高通量研究基因功能。 由 于 RNAi 能高效特异地阻断特定基因的表达使基因沉默， 因此可以作为功能基因组学的一种 强有力的研究工具。与传统的基因敲除、反义技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操 作简单等优势，近来 RNAi 成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着 RNAi 将 成为研究基因功能不可或缺的工具。 已有研究表明 RNAi 能够在哺乳动物中抑制特定基因的 表达，具有多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因 敲除的效应。另外，通过建立高通量 RNAi 功能分析方法筛选新的疾病相关基因，可以为进 一步的创新药物筛选提供更多的可能靶蛋白； 同时可以利用 RNAi 来确认许多疾病的发生发 展机制，为相关治疗提供依据。 （2） 毒性疾病的治疗 通过设计针对病毒基因组 RNA 的 siRNA 或针对宿主细胞病毒受 体的 siRNA 可以达到治疗病毒性疾病的目的。根据该设想，一系列针对人类免疫缺陷病毒 (HIV)、重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)病毒、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等 siRNA 均产生了不同程 度的的体外病毒抑制作用。研究显示，趋化因子受体 5(chemokine receptor 5，CCR5)是内源 性人受体蛋白，是主要的 HIV．1 共同受体。如果以 CCR5 为 RNAi 的靶标，将能够阻止病毒进入白细胞。最近针对 HIV 的临床前研究表明，用 siRNA 转染外周血 T 细胞，使 CCR5 表达量减少约 10 倍，而感染细胞数减少 6 倍以上[11]。siRNA 在 SARS 感染的早期阶段能有 效地抑制病毒的复制，针对病毒基因和相关宿主基因的 siRNA 能够阻断病毒感染。研究人 员用电穿孔技术转染细胞达到了利用 siRNA 消除丙型肝炎病人病毒复制的目的。该方法对 于预防肝移植受者的肝炎再感染可能非常有用。RNAi 将成为一种有效的抗病毒治疗手段。 （3）遗传性疾病的治疗[12-14]CARTHEW 和 ISHIZUKA 等人发现 RNAi 与脆性 x 染色体 综合征(FMR-1 基因异常导致的智力低下的染色体病)之间具有显著的相关性， 从而揭示了与 RNAi 相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的 RNAi 治疗成为当今研 究 RNAi 的一大热点。BEVERLY 及其同事首次利用 RNAi 对有遗传疾病脊髓性小脑萎缩症 (SCA)的小鼠进行治疗。他们构建了一种能在侵染细胞后产生具有短发夹结构 RNA 的病毒， 其序列与缺陷性 ataxin-1(一种蛋白质，是 SCA 的病因)相对应，能够直接破坏该缺陷性 蛋白特定 mRNA， 使之不能表达出蛋白。 将这种病毒注射入患有人类 SCA 病小鼠的大脑后， 其症状得到改善， 表现为处理后的 SCA 小鼠在旋转杆上保持平衡的时间比患 SCA 病小鼠的 时间长。这一成果提高了 RNA 干扰技术运用于人类临床试验的可能性。该技术也用于亨丁 顿舞蹈症的治疗研究中。 （4）肿瘤的治疗[15-17] 细胞周期素依赖激酶 2(cyclin-dependent kinase．2，CDK-2)在调控细 胞周期中发挥关键作用， 以其为靶目标的 dsRNA 能阻断 99.7％细胞中 CDK-2 的表达， 而在 对照中只有 0.2％。可以预期，通过 RNAi 技术阻断 CDK-2 的表达能用于治疗肿瘤等细胞异 常增殖相关性疾病。 Survivin 基因是最近克隆的 IAP(inhibitor of apoptosis protein)家族的具有 抗凋亡作用的新成员，在肿瘤的发生发展中起重要作用。利用 RNAi 技术抑制 Survivin 基因 的表达， 可阻断结肠癌细胞株的增殖并抑制体内肿瘤移植物的生长， 为肿瘤的基因治疗提供 了新策略。 RNAi 技术也成功地阻断了 MCF7 乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化 相关的核转录因子基因 Spl 的功能。MILNER 等应用 RNAi 技术特异性地阻断了感染 HPV 的宫颈癌细胞中的 HPV 基因，使宫颈细胞内的 V53 和 RB 蛋白恢复正常功能，宫颈细胞内 正常的防御功能得到修复，已感染 HPV 的宫颈癌细胞被杀灭，而其他正常细胞的生长和生 物学行为无改变。 （5） 在生物制药中的应用 思路是根据病原体如病毒、 细菌等的致病基因序列以及生物体内 与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列有同源序列的 dsRNA，转入动植 物内使有关的疾病基因沉默， 从而达到治疗效果。Acuity 制药公司利用 RNAi 技术开发的 治疗老年性黄斑的药物即将 RNA 将进入临床试验 ，正在等待 FDA 批准。但是 RNAi 技术 尚有许多期待解决的问题，如筛选出针对致病蛋白质而不影响细胞正常新陈代谢的 siRNA 等。 （6）其他基础研究领域[18-20] RNAi 已成为研究信号传导通路的有用工具。在信号传递 途径中， 通过 RNAi 打靶某一信号分子 mRNA， 明辨其与其他信号分子在传递通路中的关系。 还有可能通过 RNAi 产生的功能丧失表型，鉴定出参与了信号传递通路的信号分子。5 关于 RNAi 的药物的开发到目前为止， 大多数药物都是以蛋白质作为靶标， 如一些小分子的抑制剂都是以抑制蛋 白质的功能为特征，其特异性总是受到限制．在反义 RNA(antisense RNA)治疗技术中，反 义 RNA 通过引入单一 RNA 结合 mRNA 而干扰 mRNA 到蛋白质的转译， 但稳定性差， 专一 性不强，并易引起干扰素反应．而 RNAi 用双链 RNA 模拟自然过程，具有高度特异和安全 快速之特征．总之，RNAi 是基因功能分析及细胞信号通道研究中的一个十分有效的方法， 用于医药开发研究具有很大的潜力．6 RNAi 的发展前景尽管 RNAi 技术飞速发展， 但在机制研究和应用方面还有许多问题需要解决， 首先 RNAi 的机制仍不是十分清楚，在应用研究领域，最主要的问题还是转运系统的选择，比如找到一 种高效而低毒的用于人体的转运载体。总之，随着研究的进一步深入 RNAi 必将成为基因功 能研究和疾病基因治疗的革命性工具， 具有广阔的应用前景。参考文献： [1]DYKXHOORN DM,NOVINA CD,SHARP PA.Killing the messenger:short RNAs that silence gene expression[J].Nat Rev MolCell Bio.):457-467. 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