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& & 最近遇到一个问题，就是跨内含子，设计了很多对定量的引物，但P出来的产物一直是非特异性的，好几条条带，
& &&&然后一个老师建议我提出RNA来用DNA酶处理后，就在一个外显子内设计一对引物，这样不跨内含子，应该不会出现非特异性大小不一的条带，这样上荧光定量出来的结果也是可靠的，
& &&&大家讨论下这个方法可行吗？如果可行，那我们为什么在设计荧光定量引物时要跨内含子设计呢？或者有人这样做过吗？希望大家能解决我这个疑问~~~~谢谢~~~~
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可以的，其实跨内含子的主要原因是防止基因组的污染，既然你的RNA用DNA酶处理了，就不存在基因组污染了。就没有必要跨内含子了，引物怎么好就怎么设计就行，不用考虑内含子不内含子的问题了
该用户从未签到
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同意上面仁兄的观点，只要能避免基因组污染，扩增出特异性条带就行
签到天数: 3 天[LV.2]偶尔看看I
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是的，只要你有足够的自信把基因组DNA都处理干净就可以
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谢谢楼上们，真不知道有没有足够自信把DNA消灭干净呀，呵呵~~~~~
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我认为还是跨内含子设计比较稳妥一些！
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我设计的定量引物一般都会考虑到跨过内含子的
该用户从未签到
一直没搞懂
签到天数: 1 天[LV.1]初来乍到
恩啊，我的用DNA酶处理了，也跨内含子了，但是悲剧了，有引物二聚体
该用户从未签到
同意二楼的观点
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩荧光定量PCR引物设计原则-五星文库
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荧光定量PCR引物设计原则
导读：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性，11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，13.引物设计避免DNA污染，17.引物设计的软件Primer5.0有专门针对荧光的，设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率，引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡，设计引用有一些需要注意的基本原理：，标记生
1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域
内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。
2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物长度
一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。
④ 避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤ 与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。
BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。
将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI
号也可以直接
输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。
可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。
⑥ 引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
⑦ 引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
⑧ 为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。
很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。
a 添加限制性内切酶酶切位点
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引物设计的几点重要原则
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你可能喜欢如何确定mRNA中被剪掉的内含子的位置(内含子,外显子,引物设计,引物) - PCR实验 - 生物秀
标题: 如何确定mRNA中被剪掉的内含子的位置(内含子,外显子,引物设计,引物)
摘要: [如何确定mRNA中被剪掉的内含子的位置(内含子,外显子,引物设计,引物)] SYRB用real time PCR要求至少一个引物设计时跨内含子或一对引物设计于同一个外显子内，请问根据已知的mRNA序列，如何确定被剪掉的内含子的位置？或者说外显子的分布？谢谢 关键词:[内含子 外显子 引物设计 引物 序列]……
SYRB用real time PCR要求至少一个引物设计时跨内含子或一对引物设计于同一个外显子内，请问根据已知的mRNA序列，如何确定被剪掉的内含子的位置？或者说外显子的分布？谢谢
回复呵呵，这正是以前困扰我的问题。可在NCBI上找到相关信息。在genebank中可找到如下（以一GAPDH为例）mRNA join(1..52,293..344,,,, ,,,)格式的数据，其中未显示的数字中即为内含子。如52－292间。在mRNA序列中假设你的引物扩增的序列为42－142间则为跨外显子。若在185－290间则未跨。说的有些不清楚，你能看明白么。或者换个方式，还是上面的例。（52－1＋1）＋（344－293＋1）＋（）＋（）.....+()　若你的序列值落在（）值内则在同一外显子内，若在两个（）值中则跨外显子。回复补充说明，可以通过NCBI的BLAST比较同源序列，找出同源性高的序列，然后确定外显子和内含子的划分。例如AY609524： 1 ccggctctca cccctcggag aggcgcgccg gacagcagag cgcccgtcgc ccagccacgc 61 ccgccggcca gcccgccacc accatgctgg gtagcaagcg actggggctg tccagactga 121 ccctcgccct gtccctgctg gtgtgcctgt gtgcgctggc cgaggcgtac ccctccaagc 181 ccgacaaccc cggagaggac gcgccggcgg aggacttggc cagatactac tcggcgttga 241 gacattacat caacctcatc accaggcaga gatacggaaa acgatctagc cccgagacac 301 tgatttcaga cctcttgatg agagaaggca cggaaaatgt tcccagaact aggctcgaag 361 acccttctgt gtggtgatgg gaagtgaaac ttgctctccg gtctttgcct atttttcaac 421 ccccgtttta tcctgtaaga ctcaagtctg ctggccctcc ccttgcatgc agcccctctg 481 ctcctgtcct cagactttcc cttggtcgcc attgtatata cgtgcattta aataaagtaa 541 ccatgcattc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aactcgaggg ggggcccg1.NCBI 2.BLAST-BLAST3.Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)
部分结果如下：>gi||gb|AC| Homo sapiens BAC clone CTB-118E13 from 7, complete sequence Length = 185516 Score = 262 bits (132), Expect = 1e-66 Identities = 174/188 (92%) Strand = Plus / Plus Query: 84 atgctgggtagcaagcgactggggctgtccagactgaccctcgccctgtccctgctggtg 143 ||||| |||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||Sbjct: 156291 atgctaggtaacaagcgactggggctgtccggactgaccctcgccctgtccctgctcgtg 156350 Query: 144 tgcctgtgtgcgctggccgaggcgtacccctccaagcccgacaaccccggagaggacgcg 203 |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| || |||||||| Sbjct: 156351 tgcctgggtgcgctggccgaggcgtacccctccaagccggacaacccgggcgaggacgca 156410 Query: 204 ccggcggaggacttggccagatactactcggcgttgagacattacatcaacctcatcacc 263 || ||||||||| |||||||||||||||||||| || |||| ||||||||||||||||||Sbjct: 156411 ccagcggaggacatggccagatactactcggcgctgcgacactacatcaacctcatcacc 156470 Query: 264 aggcagag 271 ||||||||Sbjct: 156471 aggcagag 156478 Score = 121 bits (61), Expect = 2e-24 Identities = 76/81 (93%) Strand = Plus / Plus Query: 270 agatacggaaaacgatctagccccgagacactgatttcagacctcttgatgagagaaggc 329 ||||| ||||||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||Sbjct: 160547 agatatggaaaacgatccagcccagagacactgatttcagacctcttgatgagagaaagc 160606 Query: 330 acggaaaatgttcccagaact 350 || ||||||||||||||||||Sbjct: 160607 acagaaaatgttcccagaact 160627 Score = 58.0 bits (29), Expect = 3e-05 Identities = 56/65 (86%) Strand = Plus / Plus Query: 351 aggctcgaagacccttctgtgtggtgatgggaagtgaaacttgctctccggtctttgcct 410 ||||| ||||||||| | |||||||||||||| ||| |||||||||| || |||| |||Sbjct: 162711 aggcttgaagaccctgcaatgtggtgatgggaaatgagacttgctctctggccttttcct 162770 Query: 411 atttt 415 |||||Sbjct: 162771 atttt 162775 Score = 54.0 bits (27), Expect = 4e-04 Identities = 60/71 (84%) Strand = Plus / Plus Query: 3 ggctctcacccctcggagaggcgcgccggacagcagagcgcccgtcgcccagccacgccc 62 ||||||||||||||||||| || |||| ||||||| || | | |||||||||||||||Sbjct: 155252 ggctctcacccctcggagacgctcgcccgacagcatagtacttgccgcccagccacgccc 155311 Query: 63 gccggccagcc 73 || |||||||Sbjct: 155312 gcgcgccagcc 155322根据AC序列和按照楼上的方法便可初步划分外显子和内含子。回复用NCBI主页上的orf-finder，已知一个RNA链会有六种读码方式，5‘-3’有三种，预测出来的结果中会有一个（绿色的条）最长的ORF（open reading frame),只有这个是最可能的剪切方式，其它白色的部分就是内含子，具体位置会显示的地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html回复谢谢大家everever说的我明白是明白，只是如何在genebank中找到如下（以一GAPDH为例）mRNA join(1..52,293..344,,,, ,,,)？？？liushq的BLAST方法我最初也想过，只是觉得好好麻烦哦，我要做二三十个基因，光引物不得设计N天！有没有简单点的方法呢？不过真的谢谢你如此详细的讲解！zw517的意思是不是，输入序列后得到的许多条绿白相间的长条中length最长的那个就是最可能的剪接方式，其中绿色为外显子，白色为内含子？回复对啊~回复但是，长条序列中绿色部分就是mRNA的CDS区啊？意思就是mRNA序列中CDS是外显子，其余都是内含子吗？那不就是在CDS中设计引物吗？好象不大对吧？！zw517，我还有点糊涂呢，可否请你以大鼠SOD2为例，示范一下啊！！回复抱歉偶看贴的时候太粗糙了，认为你是要用mRNA作为模板ORF-finder是用来寻找mRNA内的外显子的，如果你是要用做模板来做PCR扩增想要确定外显子的位置只能用上面的朋友说的blast的方法比较偷懒一些的办法就是A.把你克隆的那一段基因所在位置的全序列拷贝下来，并建立一文档B.并把该序列与你的mRNA做blast,NCBI会给出按片段从大到小排列的外显子的位置C.将那些匹配的位置与文档中完整DNA序列位置一一对应，并将颜色变为红色D.根据需要选取DNA序列设计引物误导了你真是抱歉：）回复在NCBI中search ＿＿＿for_______的下方有　　display______一选项,这一选项是一下拉菜单，选genebank.就会出现相关信息，含很多内容，如下（另一GAPDH基因），下面原文还有，略过。 AY905073. Reports Emys marmorata gl...[gi:] Links LOCUS AY bp DNA linear VRT 01-JUN-2005DEFINITION Emys marmorata glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene, exons 11, 12 and partial cds.ACCESSION AY905073VERSION AY GI:KEYWORDS .SOURCE Emys marmorata ORGANISM Emys marmorata E M C C V E T C T E Emys.REFERENCE 1 (bases 1 to 452) AUTHORS Spinks,P.Q. and Shaffer,H.B. TITLE Range-wide molecular analysis of the
pond turtle (Emys marmorata): cryptic variation, isolation by distance, and their conservation implications JOURNAL Mol. Ecol. 14 (7),
(2005) PUBMED REFERENCE 2 (bases 1 to 452) AUTHORS Spinks,P.Q. and Shaffer,H.B. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (25-JAN-2005) Evolution and Ecology, University of California, Davis, 3310 Storer Hall, Davis, CA 95616, USAFEATURES Location/Qualifiers source 1..452 /organism="Emys marmorata" /mol_type="genomic DNA" /specimen_voucher="tissue sample HBS39859, H. B. Shaffer, U. California, Davis" /db_xref="taxon:251358" /country="USA: Oregon, Klamath Co., Lost River" gene 452 /gene="GAPDH" mRNA join(452) /gene="GAPDH" /product="glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase回复谢谢各位，突然想到：mRNA中的CDS部分不就是一个完整的外显子吗？这样，只要扩增片段在CDS区不就可以了吗？是不是啊？回复谢谢各位，突然想到：mRNA中的CDS部分不就是一个完整的外显子吗？这样，只要扩增片段在CDS区不就可以了吗？是不是啊？在CDS区意味着在外显子里，但不一定跨外显子。回复real time PCR实质不就是RT-PCR吗？那为什么“要求至少一个引物设计时跨内含子或一对引物设计于同一个外显子内”---难道你扩基因组啊？回复
我是这样做的，希望可以帮到你1. 在NCBI 中找出目的基因的CDS2. 连接到网站，http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start 进行Blat；将基因CDS序列粘贴到框内，选择适当的物种，如mouse；最后点submit3.首先显示的是目的基因的CDS在基因组上比对的结果，选排列最靠前，identity分最高的结果，点击details4.新网页中蓝色字母是你的CDS，黑色字母即是内含子，不过需check一下蓝黑字母交界处是不是GT /AG剪切位点。再有就是为什么要跨内含子来设REAL TIME PCR的引物？ 这主要是避免目的片段在DNA上的扩增，如果你的基因是单外显子，那你就直接在CDS设引物，但需将提取出来的RNA用DNA酶消化一下。其实多外显子也可以这样做，但引物还是能跨内含子最好，毕竟RNA多一步处理就多一次降解机会。这个需自己斟酌，祝好运回复katie80881 你好：按照你的方法， “连接到网站，http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start 进行Blat；将基因CDS序列粘贴到框内，选择适当的物种，如mouse；最后点submit”， 若该物种不在所选择的方框内，该怎么办？谢谢！回复谢谢katie80881 ！对我太有用了！不过还请解释4.新网页中蓝色字母是你的CDS，黑色字母即是内含子，不过需check一下蓝黑字母交界处是不是GT /AG剪切位点。“GT /AG剪切位点”代表何意义？是不是这里下面的黑色字母就不算内含子了？回复要确定mRNA被被剪掉的内含子的位置,可以通过DNA和mRNA杂交呀,mRNA不就是根据DNA来的吗,而mRNA与DNA不同之处也刚好剪掉的内含子回复to njstevens你去比过没有？网页最上面有说明.仔细看一下,有问题再交流。跨内含子设引物就是我上面说的，引物最好位于内含子外显子交界处，或者位于外显子上也可回复to lfhu_hn337 有相近物种的可参考，如果都没有，我也不知道了。
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