细胞骨架与细胞迁移研究进展
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细胞骨架与细胞迁移研究进展
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核心提示：1细胞骨架概况
细胞骨架是真核细胞中与维持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络，它决定着细胞的形态，由微丝(mi-crofilaments)、微管(microtubules)和中间丝(intermedia
1细胞骨架概况
&&& 细胞骨架是真核细胞中与维持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络，它决定着细胞的形态，由微丝(mi-crofilaments)、微管(microtubules)和中间丝(intermediatefilaments)组成。它们均由单体蛋白以较弱的非共价键结合在一起，构成纤维型的多聚体，易于进行组装和去组装，这正是实现其功能所必需的。
1．1微管微管是一种带有极性的细胞骨架，直径25nm左右。它是由a，B两种微管蛋白亚基结合形成微管蛋白二聚体，再由微管蛋白二聚体组成的中空长管状细胞器结构。微管具有维持细胞形态、辅助细胞内物质运输的功能，且可与其他蛋白共同结合生成多种结构如纺锤体、中心粒、鞭毛、纤毛、神经管等结构。
&&& 微管具有生长速度较快解离速度较慢的(+)端和生长速度较慢解离速度较快的(一)端，另外它还是两种运载分子驱动蛋白(kinesin)和动力蛋白(dynein)的行走轨道，与胞浆内的物质运输有关。黏着斑是黏着斑蛋白(Vinculin)将微丝固定到细胞膜上形成的，当细胞迁移时，微管连同附在其上的动力蛋白可能会释放信号，促进黏着斑的解聚，而后者是黏着斑的周转和其尾部与底质分离过程中重要的一步。
1．2微丝微丝(microfilaments)是由两股方向相同的肌动蛋白丝以螺旋的形式组成的纤维，呈圆筒状，是细胞骨架的主要成分之一，其直径约7nm。微丝和它的结合蛋白(association protion)以及肌球蛋白(myosin)三者构成化学机械系统，利用化学能进行机械运动，具有收缩功能。微丝的延长为细胞的运动和迁移性转移提供动力。微丝能被组装和去组装，交联蛋白(cross&linking protein)有两个以上肌动蛋白结合位点，起到连接微丝的作用。
1．3中间纤维& 中间纤维(intermediate filaments，IF)直径10nm左右，主要起支撑作用，是最稳定也是最复杂的细胞骨架成分。不同于微管和微丝，中间纤维是非极性的，不能支持分子有方向性的运动。大多数细胞中含有一种中间纤维，少数细胞含有2种以上。中间纤维具有组织特异性，不同类型的细胞含有不同的IF蛋白。近年来研究表明，肿瘤细胞转移后仍保留有源细胞的IF，因此可用IF抗体来鉴定肿瘤细胞的来源。
2细胞迁移及其调控因子
&&& 细胞迁移是生物体的一个十分重要的生命过程，一般把细胞迁移的过程大致分成以下4步：①细胞前端伸出板状伪足；②伪足于细胞外基质形成新的黏着斑；③细胞体收缩；④细胞尾端和周围基质的黏着斑解离致细胞向前运动。细胞迁移在肿瘤细胞转移中必不可少，而细胞定向运动同样需要细胞骨架，尤其是由肌动蛋白组成的微丝骨架的参与。肌球蛋白的收缩、肌动蛋白的聚合、细胞的黏附都会影响细胞的迁移。其中肌动蛋白收缩和聚合的协同作用调控机制以及活体中肌动蛋白的动力学作用在此过程中也较为重要，进而影响着肿瘤转移的发生、发展。
&&& 肌动蛋白(Actin)有仪、B、y三种亚型，主要分布于真核生物细胞质中，也有少量存在于细胞核中，Actin根据其聚集状态的不同可分为聚集的F&actin(6lment&actin)和单体的G&actin(dobule&actin)。在细胞前沿actin聚合产生的微丝的延长以及由肌球蛋白介导的微丝在细胞尾部的收缩被认为是动物细胞迁移的主要驱动力，在细胞的运动过程中起了重要的作用。Actin的聚合和解聚是由众多的结合蛋白ABPs(actin binding proteins)来调节的，已经分离的ABPs大约有162种，其中至少有12种是细胞膜结合蛋白，有9种是膜受体或离子载体，13种可交联微丝，其余的主要是起连接微丝与微管或微丝与中间丝的作用。
&&& Profilin：Profilin是广泛存在于真核细胞中的一种小分子量的肌动蛋白结合蛋白，能够调控肌动蛋白的聚合和解离状态。它与ADP&G&actin结合的亲和力较高，当收到信号通路传来的信号时能够促进ADP向ATP转变，从而维持细胞内ATP&G&actin数量的稳定，加快微丝的生长速度。
& Arp2／3复合物：Arp2／3复合物是一种由两个与actin相关的蛋白(Arp2和Arp3)和五个其它蛋白组成的七蛋白复合体，位于细胞膜的波动边缘，它能够与F&actin的侧面结合。由于它与actin在结构上具有同源性，能够促使actin成核，因此能制造F&actin的分支点，使微丝产生新的F&actin分支。板状伪足(1amellipodia)中微丝聚合就是Arp2／3复合物介导的，它可在数秒内组装微丝。& ADF／cofilin家族：ADF／cofilin家族均为actin解聚因子，它们都可以提高肌动蛋白单体的水平，且都可以与F&actin以1：1的摩尔比结合。ADF(actin depolymerizingfactor)主要位于上皮细胞和神经元细胞中，cofilin有两个亚型，分别是cofilin一1和cofilin一2，前者主要位于肌肉细胞中，而后者主要位于非肌肉细胞中。Cofilin是一种细胞分化调节因子，细胞静止时，主要位于细胞质中，细胞运动时则分布于细胞膜的边缘。ADF／cofilin能够与微丝的亚尖端结合，提高actin单体的解离速率，并减缓ADP&G&actin复合物中核苷酸的交换，及向ATP&G&actin的转变，从而抑制actin重新组装成微丝。ADF／cofilin还能够对F&actin进行剪切，从而产生更多的actin聚合位点，促进微丝的组装。ADF／cofilin位于正在迁移的细胞的前端，能够降解已存在的微丝并为新的微丝提供生长所需要的游离G&actin，这对细胞的运动非常重要。另外，eofilin还具有去分支作用，可和Arp2／3复合物竞争与actin的结合，对其进行抑制。
3细胞迁移中的传导通路
&&& FAK：黏着斑激酶，大部分的FAK存在于黏着斑中，少部分的FAK存在于细胞质中。FAK为非受体酪氨酸激酶，与细胞骨架的动态变化和黏着斑的解离有关，主要参与肿瘤细胞的迁移、黏附和侵袭功能，是肿瘤细胞信号网络的关键调节因子。当FAK在细胞内接收到各种刺激信号后，作为传感器通过下游复杂的信号网络影响细胞骨架、黏着斑和细胞膜的突出，最终影响细胞迁移和侵袭能力。最近研究发现，FAK&Tyr397的磷酸化能够使FAK在黏着斑上的滞留时间增加，使细胞尾部黏附的微丝解离，促进细胞的迁移。
& Rho GTPases：Rho GTPases是一类Rho家族中的有GTP酶活性的蛋白，目前已发现有20多个Rho家族的成员，其中RhoA、Racl和Cdc42最为常见。Rho GTPases与GDP结合无活性，而与GTP结合则呈激活状态。Rho GTPases通过非常复杂的信号通路控制着细胞的某些最基本的生物功能，如细胞极化、细胞运动和细胞分裂等。Rho GTPases通过控制细胞骨架蛋白的聚集和解离，在细胞的极化和迁移过程中起到了中心枢纽的作用。Rho GTPases还控制着微丝的组装。Rho主要在迁移细胞的中部和尾部发挥功能，负责指导细胞尾部黏附的蛋白释放和细胞体的收缩，并可调控细胞微管骨架，是调节迁移的关键分子。
& MAPKs：MAPKs(mitogen&activated protein kinases)家族包括JNK(Jun N&terminus kinase)、P38和ERK(ex&tracellular signal&regulated kinase)等，它们在结构上的共同点是在激酶区都包含Thr&x&Tyr序列。MAPKs主要介导了细胞外部信号传导至细胞内部的过程，是细胞的迁移过程所必需的物质，所有的真核细胞内都有若干条MAPKs通路作为重要的信息传递途径，以应对细胞内外环境的变化。当JNK、P38和ERK通道被激活后，会引起微丝的重排和相应的细胞形态改变。研究表明，P38参与了生长因子和细胞因子介导的细胞迁移，其与ERK通路共同调节微丝重排时细胞的迁移能力，但是其作用机制尚不十分清楚。ERK是细胞运动过程中重要的调节因子，它通过不同的途径调节细胞的迁移。它通过磷酸化MLCK增加其活性，使MLCK能进一步磷酸化来激活myosinⅡ，从而促进微丝的收缩，加速细胞的迁移过程。ERK还通过磷酸化m&calpain参与黏着斑的解聚过程，并能通过多种途径影响细胞的粘附过程。
& P13K：P13K活化后产物PtdIns(3，4，5)P3在细胞膜上聚集后，能促进细胞极化的过程，进而与P13K一同调节细胞的迁移过程。在许多细胞中，PtdIns(3，4，5)P3都能够显著提高GTP&Rac的水平。具体机制是PtdIns(3，4，5)P3直接与Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子(Rac&GEF)结合，激活Rac并使活化的Rac在细胞迁移方向上积累，活性的Racl(即Racl&GTP)进一步增强P13K的活性，形成一个正反馈循环，激活A~p2／3复合体，进而启动actin的聚合促进细胞的迁移。
&&& 细胞迁移在肿瘤转移中起着重要作用，尽管近年来对细胞迁移分子机制的研究取得长足进展，但仍有很多问题需要解决&&如迁移过程中黏附的建立和解离的精细调节机制，微丝和微管在迁移中的相互协调作用机制等。对细胞迁移的分子机制不断深入认识不仅有助于一些生理现象的进一步阐明，同时也将为治疗肿瘤的药物开发提供更多新的思路。&&
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ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
试剂、试剂盒
仪器、耗材
盖片培养细胞（70 %～80 %汇合），PBS洗3 次；
2 %的甲醛/PBS 液（甲醛按37 %）固定3 分钟；
0.5 %的三硝基甲苯/PBS处理3 次，每次10 分钟；
PBS漂洗3 次；
用罗丹明（Rodamine）标记的鬼笔环肽（Phalloidin）（1:10）室温中反应15 分钟；
PBS漂洗3 次；
60 %甘油+荧光防淬剂封片；
荧光显微镜检。
实验方法原理
细胞骨架微管的主要成分主要为管蛋白（Tublin），用免疫荧光法能显出其清晰结构。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
细胞培养用支持物细胞培养法，把细胞培养在小盖片上；
用镊子挟出小盖片，在温PBS中漂洗3 次，每次30 秒；
在室温中用PBS配的3 %甲醛液固定20 分钟；
从固定液中取出，仍用温PBS漂洗3 次，每次1 分钟，最后在滤纸上吸干多余的PBS；
投入冷丙酮中（－10 ℃～－20 ℃），令细胞面向上，作用7 分钟；
取一直径6 厘米干净的碟皿，向皿中央滴1 滴浓度为0.1～0.2 mg/ml的一级抗管蛋白抗体，令小盖片细胞面向下扣在抗体液上，覆以皿盖，置37 ℃温箱中45 分至1 小时（内有水盒以避免抗体液蒸发干掉）；
向碟皿内徐徐滴加PBS，令盖片浮起在液面，用镊子挟出，按4处理；
二级荧光抗体处理
按7进行（荧光抗体常用羊抗兔抗体）；
按8和4处理，封片；取一大载物片，用滤纸剪一纸框置于载物片上向纸框中滴甘油/PBS（pH8.5，PBS 1 分加甘油9 分）少许，把小盖片置入框中再覆以大盖片；置荧光显微镜下观察。
荧光抗体有市售品，如无，也可参阅免疫学技术自制。
实验方法原理
荧光免疫染色法显示细胞骨架具有清晰优点，但操作过程较复杂；考马斯亮蓝染色法简便易行，清晰度稍差，但如分化处理适当能提高清晰度。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
固定液准备 0.1 M 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O） 14.0 ml
0.1 M 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 36.0 ml
蒸馏水 50.9 ml
（以上各液相混合后再加戊二醛）
25 %戊二醛 50.0 ml
甲醇 46.5 ml
冰醋酸 7.0 ml
蒸溜水 46.5 ml
（以上各液相混合后再加染）
考马斯亮蓝 0.2g
用支持物盖片培养法；
从培养瓶中取出细胞盖片，投入固定剂中固定15 分钟；
取出盖片先置蒸馏水中漂洗2 分钟，再用蒸馏水洗两次，每次1 分钟；
在考马斯亮蓝液中染色60 分钟；
按4程序漂洗；
置入含甲醇冰醋酸液碟皿中（不含染料），在倒置显微镜直接窥视下，见细胞质内微丝逐渐明显，背地清亮时便终止；
脱水→各度酒精→二甲苯；
用树胶封固；
细胞内微丝呈蓝色，如分化较好时背地清亮，反之会影响微丝的清晰度。
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微管（microtubules）
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