求助关于蛋白质脱盐柱的问题

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【求助】分离纯化后的蛋白脱盐方式
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请教一下大家,分离后的蛋白如何脱盐啊,我现在只知道sephedex G-25或G-50和透析还有超滤。但是超滤需要的量大啊,我分离出来的蛋白峰最多也就20ml左右;还有就是透析,我感觉效果不好,并且时间长,蛋白易变性;然而再过柱子呢又是挺麻烦。请问一下各位战友还有什么其他更好的办法吗? 谢谢大家了。查看完整版本请点击这里:
vcve ( 15:56:15)
我做过蛋白质纯化的脱盐,主要用梯度法,步骤有点复杂
小野花 ( 15:58:59)
其实用个脱盐柱很简单的,只要有设备,操作简单,效果好.
工业化也可行,回收率也高.
最后的浓度也不会降低很多
希望楼主不要怕麻烦
做试验就是这样的!!!
dog002 ( 16:01:04)
谢谢大家的帮助,很是感激啊!但是我还想知道一下,你们说的脱盐柱指的是什么啊?是sephedex G-25或G-50柱吗?还是还有其他更好的呢。我们实验室的蛋白纯化仪是AKTA的。
gogo ( 16:02:58)
脱盐之后,蛋白还是溶解在缓冲液中,还是有离子存在会不会影响进一步跑电泳什么的 ?
dog002 ( 16:04:29)
我感觉跑电泳是会影响的,我跑电泳都是透析冻干后在跑的,但是我这透析的效果一般,但要比直接来跑电泳要好。我的脱盐应该怎么做呢,大家快来帮帮我吧 ,我最关键的问题就剩脱盐了,脱盐后我才可以往后继续做了。
zsxan1990 ( 16:04:46)
脱盐柱就是PD-10或者NAP-5柱,填料应该就是Sephadex G25,不过厂家已经装好了,而且有一定的操作规程
huifeng0516 ( 16:05:39)
超滤有处理几ML的超滤管。使用很方便的呀。MILLIPORE就有。叫AMICON-15你可以看一下。在
glass ( 16:07:02)
请教一下大家,分离后的蛋白如何脱盐啊,我现在只知道sephedex G-25或G-50和透析还有超滤。但是超滤需要的量大啊,我分离出来的蛋白峰最多也就20ml左右;还有就是透析,我感觉效果不好,并且时间长,蛋白易变性;然而再过柱子呢又是挺麻烦。请问一下各位战友还有什么其他更好的办法吗? 谢谢大家了。
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我个人认为还是跑柱子比较好,也比较温和,对蛋白的破环也很小,但是要明确的是你的蛋白的分子量或者颗粒大小与盐溶液的比较
dog002 ( 16:07:24)
十分的感谢大家的帮助,谢谢各位了。我所提取目的蛋白的分子量是40-60KDa范围之内,盐浓度是2MNaCl的0.01M磷酸钠缓冲液
dog002 ( 16:07:41)
我找到了AMICON-15,真的是又学到东西了,谢谢!
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【求助】关于蛋白质与固体表面醛基发生键合的实验问题
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这个帖子发布于4年零113天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:5
本人是一外行,完全不懂合成。现在想把蛋白质通过其氨基与固体表面的醛基发生反应,使之连接。查阅众多文献,均暗示此反应极易进行,不需加任何催化剂,将两者放在一起孵育即可。可是本人预实验结果不理想,不知原因何在,因此请教高手指点迷津,不胜感激!我将蛋白质(人血清白蛋白)溶于含有1%NaCNBH3的PBS缓冲液(10mM,pH7.4)中,在与固体表面醛基共孵育24小时(室温),因无法直接表征蛋白是否键合上去,只能用间接地办法推测,键合并未成功。我曾找搞合成的一位老师咨询,曰:可将PBS的pH至调节到弱碱性,使蛋白质的氨基尽量游离出来而不是以离子形式存在,更有利于shiff碱的形成;又或选用吡啶的水溶液(pH6.0)做催化剂,可催化此反应。我查阅的文献里,一般都没提到用催化剂,蛋白质在PBS中即可与醛基发生shiff 碱反应。非常疑惑,恳请大侠指点迷津,究竟何种方法能使蛋白顺利与醛基键合,并不影响其结构活性。
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