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【求助】温度诱导表达外源蛋白
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这个帖子发布于4年零358天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
有一个表达系统：将两个质粒同时转到大肠杆菌里，一个质粒低温培养时表达一个阻遏蛋白，抑制另一个质粒扩增（此质粒含外源基因）；高温培养时，不表达阻遏蛋白。此表达系统先低温培养（此时每个菌种只有10个左右可表达外源蛋白的质粒），后高温培养，质粒扩增、表达蛋白。请问，此系统为何不直接高温培养表达外源蛋白，为什么要加入低温这一步？质粒编号不能说，不好意思。
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如果一开始细菌就大量表达外源蛋白会对菌体造成负荷，影响细菌生长，如果表达蛋白有毒性还会使细菌死亡。为了获得最高量的目的蛋白，只能在细菌密度达到一定程度后，开始诱导菌株产生目的蛋白。除温度诱导外，IPTG等诱导也是这个道理。自己知道的也很粗浅，以上是我自己的理解
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那就是：低温时，细菌能大量增殖，等细菌密度比较大时，再升温诱导表达，但这样就需要较长的培养时间，因为低温细菌长的较慢。好处就是能获得大量的外源蛋白。如果直接高温培养，细菌密度可能不会大，外源蛋白也就不多了。IPTG诱导就不存在上述问题了，先快速增殖，后诱导表达，培养时间短，表达量也大。那这样的话，温度诱导表达有什么优势呢，完全不如IPTG诱导啊
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wxj2901 那就是：低温时，细菌能大量增殖，等细菌密度比较大时，再升温诱导表达，但这样就需要较长的培养时间，因为低温细菌长的较慢。好处就是能获得大量的外源蛋白。如果直接高温培养，细菌密度可能不会大，外源蛋白也就不多了。IPTG诱导就不存在上述问题了，先快速增殖，后诱导表达，培养时间短，表达量也大。那这样的话，温度诱导表达有什么优势呢，完全不如IPTG诱导啊可控性比较好，IPTG和表达量的关系很多时候不是线性的。常用的高盐诱导也是这个道理。
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我们要的外源蛋白，产率高就行了。可控性好是为了控制表达速度，使蛋白充分折叠，以可溶的形式表达吗，还是有什么其他的好处吗多谢你们的回复！
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wxj2901 我们要的外源蛋白，产率高就行了。可控性好是为了控制表达速度，使蛋白充分折叠，以可溶的形式表达吗，还是有什么其他的好处吗多谢你们的回复！对，IPTG看似简单，但是实际上的诱导效果根据菌液浓度，LacI的本底表达和LacY的诱导表达而变化，所以并不适合需要精确控制的场合。蛋白胨里通常都有微量乳糖，如果蛋白的毒性很强这一点点的本底表达都会抑制生长，加入IPTG后直接就溶菌了.还有一点就是如果大量摇菌的话IPTG的消耗直线上升，50元1克的分装货几次就用完了...
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laforet edited on
laforet 对，IPTG看似简单，但是实际上的诱导效果根据菌液浓度，LacI的本底表达和LacY的诱导表达而变化，所以并不适合需要精确控制的场合。蛋白胨里通常都有微量乳糖，如果蛋白的毒性很强这一点点的本底表达都会抑制生长，加入IPTG后直接就溶菌了.还有一点就是如果大量摇菌的话IPTG的消耗直线上升，50元1克的分装货几次就用完了...多谢，受益匪浅！
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细菌中RpoS蛋白的表达调控及其功能的研究进展
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各位前辈们，小弟我最近在做蛋白的纯化了，其中很多枝节不懂，我纯化的是大肠杆菌表达的一种重组蛋白，而且此重组蛋白的表达方式是形成胞内包涵体的那种，此重组蛋白带有6聚His（组氨酸）的标签，我IPTG诱导大肠杆菌表达重组蛋白后，离心收集菌体，裂解菌体，再离心收集包涵体沉淀，然后洗涤包涵体沉淀，最后将包涵体溶解在8mol/L的高浓度尿素里，我后面该如何纯化此重组蛋白了？1、我应该先上镍柱还是先透析，或者是先透性再上柱而后再透析？
2、透析袋的作用到底是什么？网上查了很多资料，有的人说是为了使溶解在高浓度尿素里的包涵体复性的；有的人又说是为了除去包涵体里的杂质蛋白和一些小分子；有的人又说透析是为了除去上柱之后的咪唑；更有人说是为了浓缩包涵体蛋白的量的，
我自己觉得溶解在8mol/L尿素里的包涵体是应该先上柱的（因为高浓度尿素对包涵体蛋白的变性作用只是一种可逆性变性，通过镍柱之后，除去了混杂的尿素，进而解除了尿素对重组蛋白的变性作用），上柱之后紧接下来应该是透析（因为过柱之后，咪唑还混在复性的重组蛋白里面，透析之后就可以除去咪唑）。
<font color="#、还有一个问题，那就是我的这个重组蛋白因为带有组氨酸标签所以才可以通过亲和层析镍柱纯化，如果我的重组蛋白没有此标签，那我是不是就要用硫酸胺分级沉淀了，除了硫酸胺分级沉淀，我还能不能用别的方法纯化，诸如离子交换层析、等电点层析（具体情况是不是要根据目的蛋白的特点来选择）等等。高手能举一例是最好，回答的好，我将在各大论坛里发布，以解决我们这些初学者的困惑？
1.1包涵体的定义、组成与特性：
涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、
脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明
包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段 ...
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1.1包涵体的定义、组成与特性：
涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、
脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明
包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1]
1.2包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时
很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结
合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2]
1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解
1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等
原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再
结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如 2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。[3]
1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它
能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷
基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原
剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键
的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白
影响了包涵体的溶解。
二、复性：
由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到 2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
2.1包涵体蛋白复性方法
2.1.1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。
2.1.2透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
2.1.3超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
2.1.4柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其
中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一
般五倍左右）[5]
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个人认为，带标签的包涵体纯化和不带标签区别不大，关键在于包涵体复性，变性纯化以后还是要复性的。其实复性过程可以用一句话总结：在保证蛋白最少沉淀的条件下逐渐降低变性溶解蛋白中变性剂浓度，直到去除。为达到这一目的，可以采取任何优选可用手段。不局限于稀释、透析、柱层析（包括离子交换、凝胶过滤、疏水、亲和）等现有工艺和方法。
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1.1包涵体的定义、组成与特性：
涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、
脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明
包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1]
1.2包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时
很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结
合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2]
1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解
1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等
原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再
结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如 2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。[3]
1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它
能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷
基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原
剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键
的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白
影响了包涵体的溶解。
二、复性：
由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到 2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
2.1包涵体蛋白复性方法
2.1.1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。
2.1.2透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
2.1.3超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
2.1.4柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其
中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一
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1&&蛋白表达：如果不需要包涵体，可以降低IPTG的量，15度的条件下诱导。
2 8M Urea溶解的蛋白，可以先上NI柱(不过全程都要用Urea)，也可以先透析复性。先用其中一种试试，不行再用另外一种。
3 透析袋 个人认为是慢慢除去里面的Urea，便于蛋白复性(或者咪唑洗脱成分里的咪唑等小分子)，相当于有两个作用。个人认为利用透析袋复性是个很不错的方法。
希望鄙人的小小建议对你有用！好运！
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非常好，学习啦
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真是很详细啊，学习了
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好好！！！！谢谢啦。
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你这里的透析是复性蛋白的！先做哪步这不一定的，有的蛋白需要在很纯的条件下复性效果好，有的则无所谓，这都需要你自己去摸索，蛋白复性是一个很复杂的过程
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩蛋白质的功能可以影响基因的表达
是的,很多蛋白质参与对基因表达的调控,比如各种转录因子、乳糖操纵子中的阻遏蛋白等.其实RNA的聚合酶本身就是蛋白质,很多抗生素就作用在它上面,从而扰乱细菌的蛋白质合成.
答案应该是不对
但不知道为什么
。。。 我不认同这个答案
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明显不对啊蛋白质的功能是基因的表达的结果，把这个话掉个个就对了
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