简并引物的简并度多少正常 - 实验交流 - 生物秀
标题: 简并引物的简并度多少正常
摘要: [简并引物的简并度多少正常] 一般简并引物的简并度大概多少正常?简并引物PCR的退火温度能超过60度吗？（我做的梯度PCR，在58——63度都有条带） 关键词:[简并引物 简并度 氨基酸序列 碱基序列 保守序列 简并 序列]……
一般简并引物的简并度大概多少正常?
简并引物PCR的退火温度能超过60度吗？（我做的梯度PCR，在58——63度都有条带）回复1、一般来说，简并度在1024之内正常，但是超过1024是很常见的事。自己做过几对简并引物都大于1024，但是后来扩增都没问题。简并度高是因为简并引物中的N，如果有钱，可以用i（次黄嘌呤）代替N，这样简并度就会减少很多，一般都能达到要求。
2、简并引物的退火温度一般都不高，这样有利于引物本身更好的与模板相结合。简并度稍高的简并引物退火温度尽量不要超过60°，50°左右最好。
希望对lz有所帮助。回复
1、一般来说，简并度在1024之内正常，但是超过1024是很常见的事。自己做过几对简并引物都大于1024，但是后来扩增都没问题。简并度高是因为简并引物中的N，如果有钱，可以用i（次黄嘌呤）代替N，这样简并度就会减少很 ... 请问简并引物设计时是以序列做参考还是碱基序列作参考。
之前将几种序列做比对，找到保守序列在将其中一条序列输入primer5里面，设计的兼并引物的简并度很高。
但是如果将对应的碱基序列作对比，在相同的保守区，人工设计简并引物，简并度很低，一般都不超过100，请问我该怎么设计？以哪个作参考？回复
请问简并引物设计时是以氨基酸序列做参考还是碱基序列作参考。
之前将几种氨基酸序列做比对，找到保守序列在将其中一条序列输入primer5里面，设计的兼并引物的简并度很高。
但是如果将对应的碱基序列作对比，在相 ... 简并引物一般是要以氨基酸保守序列来参考的，因为密码子的简并性缘故，只有氨基酸的序列才是相对保守的。个人感觉用软件设计的简并引物并不可靠，不如自己设计。找到保守的氨基酸序列后，一般上下游各找到7-9个连续的相对保守的氨基酸区域，之后根据简并密码子表就可以轻松翻译出来。尽量不要以碱基作为参考，并不是很准确。回复无需奖励，只是觉得退火温度低于72摄氏度应该都可以
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我的引物退火温度怎么算？
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这个帖子发布于11年零126天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
S（正义链） 5'-GACATGGGGTATTGGAT-3' A （反义链） 5'-TCCATCCCATACCAGCA-3' 用于pcr时退火温度大概多少？
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我的引物是用的文献上面的，根据文献描述退火温度是55度，可是我pcr出来非特异性条带比我要的条带还亮而且出现很多非特异性的带，我该怎么调整呢？
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还是自己摸一下吧 有条带很好了 我一点都没有
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计算退火温度的方法：1. 退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8） 只是粗算，有时不灵，但比较简便。2.用primer5（or oligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2 or 3度最好。3.合成引物的单子上也有个Tm，减去5～8也可，但有些公司提供的Tm就是方法1计算的。我认为方法二最准确，不知道还有其他方法吗？
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i am more worse than you, no any belt appear for 5 days. thus make me exhausted .
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every one, good night i have have a sense chain and anti-sense chain need a expert to give me a hand.
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1、你没发现你这对引物之间可以配对么GGGTAT和CCCATA所以建议提高退火温度看看效果如何2、应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C3、降低Mg离子和引物的用量
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我是开始防暑假就开始做rt-pcr，到先在没啥满意结果（晕啊！） 曾经在8月7号出了几条480bp得条带，确实让我高兴一下，但是第二天以同样得体系和同样得退火温度.模板一样，除了引物二聚体外，啥也没有，实在没办法，昨天做内参，出来了，说明模板还没坏吧？体系内得 东西我们实验室其他人也做啊，说明也没坏吧？昨天上午请一位有做得多得姐做了，也是没结果啊！，下午又把引物重新配过了，我根本没加内参引物，到是批出几条在内参250bp得条带来，真弄不懂啊！ 我在别人得实验做，八月低就要结速啊！没办法，请各位大侠分析一下吧，小妹先谢谢师哥师姐了！！！ 今天又不知出啥带了？ 几次出带下来，感觉pcr得重复性太差了啊！ 加我吧，才可继续讨论下去啊！
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我是开始防暑假就开始做rt-pcr，到先在没啥满意结果（晕啊！） 曾经在8月7号出了几条480bp得条带，确实让我高兴一下，但是第二天以同样得体系和同样得退火温度.模板一样，除了引物二聚体外，啥也没有，实在没办法，昨天做内参，出来了，说明模板还没坏吧？体系内得 东西我们实验室其他人也做啊，说明也没坏吧？昨天上午请一位有做得多得姐做了，也是没结果啊！，下午又把引物重新配过了，我根本没加内参引物，到是批出几条在内参250bp得条带来，真弄不懂啊！ 我在别人得实验做，八月低就要结速啊！没办法，请各位大侠分析一下吧，小妹先谢谢师哥师姐了！！！ 今天又不知出啥带了？ 几次出带下来，感觉pcr得重复性太差了啊！ 加我吧，才可继续讨论下去啊！
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如果按楼上说得方法，我的primer 给我的引物退火温度是57.9和59.5度，在加2到3度，都要成61度了，又这么高的退火温度吗？？ 刚出道不久，请各位指点啊！
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引物为20mer以上时：Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L其中L为引物的长度。这是计算引物的Tm。一般情况退火温度比引物的Tm低五度左右，不过要根据自己的情况摸索条件。祝你成功！
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引物为20mer以上时：Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L？？？看不懂，楼上能否再解释一下？
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还有一个关于引物与原序列符合的问题我的引物与ncbi上的原序列比对有2～3个碱基不符合，这样会不会影响RTPCR呢？盼望高手指教。
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按照文献上面很多条件做都做不出来，我们实验室都是自己先摸温度梯度的，然后确定退火温度。还有因为基因组数据库有好几个，所以，有个别碱基对不上应该也是可以的，但是不能太多。
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退火温度与延伸温度接近还更好呢你退火后，还要升温再连接，这升温也对退火的效果有影响吧？而退火后直接延伸不是更好么可以采取两段的PCR退火与延伸一块进行
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感谢各位老师的建议和指导。谢天谢地，我的RTPCR终于出来了，我把其中一条有错配碱基的引物按照原序列改回来又合成了一条，这次扩出来了。我是按照文献上面的退火温度是55设置的，但是条带不亮，而根据引物合成单上面Tm值是一个50，一个52，我想条带不亮是不是我的退火温度太高了呢？请各位老师再帮我分析一下。我的体系如下：10倍buffer
2.5ul10mmoldNTPs
1ul20pmol/ul引物
各0.5ulTaq酶
1ul模板cDNA
9.5ul93度5分
（93度40s ，55度45s ，72度1m）X30，72度10分我应该怎么调整我的实验条件呢？
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1、变性为什么93度，不设高点，94度45S2、Mg离子呢？多加点。反应体系中Mg2+浓度低时，酶的活力显著降低；一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。3、引物的浓度一般要求在0.1~0.5uM之间，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；4、温度高没坏处，高于55℃的复性温度，可提高Taq pol的忠实性。多加几个循环。
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退火温度还是自己摸一下比较好，计算永远是教条的。换台PCR仪可能都会不一样呢。
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关于丁香园|/|/|/|/|/|
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【求助】一个关于PCR扩增的简单问题
请问各位老师:
我正在做一个基因的克隆表达,已经完成克隆,扩增的时候用的是简并引物,进行序列测定以后,经过序列分析重新设计了特异性引物扩增其完整序列.
我想请问一下各位老师的是:特异性扩增时扩增条件是不是应该一样呢?(例如退火温度等)另外,特异性引物扩增是不是应该一条DNA带呢?我的扩增怎么用原来一样的条件扩不出来呀?怎么也不是一条带.我可不可以用胶回收、纯化后直接进行与载体进行连接、转化呀？这位同学,不知你简并引物的扩增的目的条带,是怎样拿去测序的?直接把条带纯化后测序还是连入T-Vector后测序的呢?一般我们都是把目的条带连入T-Vector后挑单克隆保种后拿去测序,这样在测序过后,设计特异引物,直接从连入目的片段的T-Vector上扩增即可.条件的控制兜不用很严格,就可以扩出来.仔细看了两遍，大体明白了你的意思：你是先用兼并引物得到了所要的基因（估计应该是回收的优先扩增的特异条带去测序），根据测序结果又设计了特异性引物进行扩增，结果没有得到想象中的单一特异性条带。针对你的问题，我的看法是：1.特异性扩增时扩增条件没必要和兼并引物时一样，尤其是退火温度：因为我们都知道兼并引物的TM值是很难确定的，一般都需要做降落PCR，变动的温度范围相对比较大；而特异性引物的TM值是已知的，有时直接用引物合成报告单上给的TM值就可以得到非常特异的扩增条带，即使不特异，在给定的TM值上下很小的范围内稍微调整，也可以得到比较理想的条带。2.既然是特异性引物，严格来说，扩增后就应该得到单一的特异性条带，你只所以没有得到，很大原因就是因为PCR的TM值你没有选择好，这时的TM值和兼并引物时的应该有差别的，它应该范围更小、更特异、要求更高。如果你有梯度PCR仪，作一个梯度PCR一般就可以摸索到理想的TM值。当然了，如果已经有了优势扩增的特异性条带，尽管有些非特异性杂带，但不影响整体的结果，你完全可以采取和兼并引物扩增回收一样的方法，直接用胶回收、连接去测序；如果你想要一个好的电泳图可以用回收的样品跑一个（样品充足的话），也可以再用特异性引物做一个菌落PCR，那个条带单一而且很亮（我经常这样做，呵呵）谢谢各位老师!我真是收益非浅!我打算用胶回收然后纯化的方法进行连接、转化，摸索条件太麻烦了，我主要是想要和表达载体连接后进行表达，所以是不是不用非得一条带呀？没必要非得单一的条带，回收纯化的单一、特异性条带可以和表达载体连接后进行表达
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摘要 : 简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。
简并的方法(包括实际操作步骤)
简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种的一种方法。
设计的常见程序如下：
1. 利用搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
2. 对所找到的序列进行多序列比对。
将搜索到的同一的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，也可选工具Clustal W，也可在线分析www.ebi.ac.uk/clustalw.
其结果如下图所示，所有序列的共有部分将会显示出来。&*&表示保守，&：&表示次保守。
3. 确定合适的保守区域。
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸为宜，使得产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸，因为每条引物至少18bp左右。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
4. 利用软件设计引物。
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用pp5进行简并引物的设计。将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差一个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示(其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G， D=A/G /T，N=A/C/G/T)，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。
最好使用专门的简并引物设计方法如
：CODEHOP bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html
GeneFisher2 bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/
在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法，该方法要求的保守区较短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。该方法主要是通过将简并区放在3&末端，并在5&端设计一个一致性的区域来降低兼并度。
5. 对引物的修饰
若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度=4&2&4&3&4&3&2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N(因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对)和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。
注意：该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。
引物中符号说明：
M 代表A or C
R 代表A or G
W代表 A or T
S代表 C or G
Y代表 C or T
K代表 G or T
V 代表A or C or G
H 代表A or C or T
D代表 A or G or T
B 代表C or G or T
N代表 G or A or T or C
由于引物的简并性的问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率降低，PCR产物非特异性增高。
虽然减少简并引物长度可以相对减少简并性，但随之而来的问题是引物的Tm值过低，有时不得不设计第二对引物对PCR产物进行二次扩增，即巢式PCR，或者需要与Touchdown PCR相结合使用。
与通常设计的简并引物不同，利用CodeHop方法设计简并引物。引物由两部分组成：引物3&端为根据4-5个保守氨基酸设计的核心简并区(3&core region)，长度只有11-15个碱基;引物5&端为非简并性夹板结构(5&consensus clamp region)。5&端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性序列，它最大程度的预测了保守性氨基酸的编码序列，其长度取决于所需的退火温度。这样设计的优点在于既减少了引物的简并度，又提高了引物的退火温度，保障了PCR产物的特异性。标准简并PCR在聚合反应的晚期，随着产物的增多，引物的非特异性结合的现象增多;而CodeHop PCR的晚期，这种现象大为减少。实验结果表明，按这种方法设计的简并引物非特异性扩增减少，是一种快捷方便的简并引物设计方案。
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