心肌成纤维细胞培养原代培养求助

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-06 07:03 标签： 心肌成纤维细胞
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新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维细胞分化模型的建立
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内容提示：新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维细胞分化模型的建立
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新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维
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心肌成纤维细胞的培养
心肌成纤维细胞的培养
来源：互联网
点击次数：5227
丁香园网友卡列宁的微笑的观点：
用Langendorff灌流消化（胶原酶II）只能取得心肌细胞。建议直接将心脏剪碎，成纤维细胞我们这里一般采用0.05％胰酶消化。无菌条件取出心脏D-hank's液（PBS也可）漂洗，剪碎心脏加入5倍体积消化液，37C水浴3－5min，反复吹打，静置，待自然沉降后弃去上清液。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08%胰蛋白酶及0.1%胶原酶II混合液，反复吹打，大约10分钟（消化时间往往靠经验的判断），离心取沉淀重悬于含20％BSA的DMEM（有条件可以用Cascade的培养液）。60－90min后更换培养液（差速贴壁，成纤维细胞比心肌细胞贴壁快）。
1、胰酶的作用比较强烈，联合使用胶原酶将胶原纤维充分消化后利于离心时细胞沉淀，提高细胞存活率。另外，消化时间不宜太长，主要凭观察和经验来判断。离心采用1000rpm 5min。
2、酶的配置可以用d-Hank's液或生理盐水都行。血清的作用主要是终止消化，用一般加了血清的DMEM就行，我们这里是20％胎牛血清。
3、贴壁时间：我师兄曾经告诉我2hr，现在我觉得90min已经很好了。
4、细胞可以先用台盼蓝测定存活率。
5、鉴定：在倒置显微镜下观察，细胞呈梭形、多角形，细胞质透明，细胞核大，呈椭圆形，常含有2－3 个核。IHC可以用I抗体（动物抗人B3、抗波形蛋白、抗血管平滑肌肌动蛋白）其余基本按IHC的步骤来。
丁香园网友googles的观点：
1、用0.05或0.08%的胰酶消化成年大鼠心脏, 效果欠佳, 我是用0.25%的浓度, 分次消化, 6-7次后心脏才能消化完全.
2、由于胶原酶昂贵,我采取的办法是胰酶数次消化得到的细胞及细胞团块综合后,用0.1%的胶原酶消化2次,如此可大大提高细胞得率, 弥补胰酶消化细胞得率低的缺陷.
3、CF应该用2-4代做试验. 由于大鼠细胞只有8代左右的寿命.且5代后细胞的表形将改变, 其增殖能力也显著下降. 因此建议用2-3代的细胞.
4、CF的免疫组画鉴定如果降低标准是比较简单的, 正轨的鉴定很复杂.我是鉴定3个, Vimentin(+)表示细胞来源于间充质, Ⅷ因子(-)表示细胞为非血管内皮细胞. α-actin(-)可排除心肌细胞. 总的说来CF是通过排除法来鉴定的.
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【求助】关于成年大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞原代培养
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大家好，我是刚开始做细胞试验，以前从来没有接触过，主要做成年大鼠心肌成纤维细胞传代和心肌细胞的原代培养，谁有具体步骤啊，好心发一份，谢谢大家了
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你大鼠提的怎么样。。。。我提的特别脏。不如新生小鼠。
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【求助】原代心肌成纤维细胞的传代培养
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这个帖子发布于2年零221天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
做完原代心肌成纤维细胞后，想要进行下一步实验，需要对细胞进行消化传代，但是细胞在消化时由于细胞贴壁紧密程度不同，总导致一部分细胞先消化下来，另一些细胞仍旧贴壁，并用枪吹不下来，后来分次消化但感觉细胞状态不佳，想请教做心肌成纤维细胞的大师们是如何消化的？最好叙述一下详细步骤，消化时镜下观察到什么程度终止消化。
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我也正遇到相同的问题，求较。希望也能跟楼主一块探讨经验。
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你们养原代心肌成纤维细胞的目的是？？可以私信我！
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我是做心肌纤维化的细胞模型，需要传3～4代。
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你的先在显微镜下观察，细胞变圆变亮你在往下吹，要不然会损伤细胞的！
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cheff0412 edited on
那要多长时间？估计得很长吧。
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但是细胞会有一部分变圆变亮了，另外一部分仍贴壁很牢，这样的话应该怎么办
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zxz91 但是细胞会有一部分变圆变亮了，另外一部分仍贴壁很牢，这样的话应该怎么办 我最近做的话，如果剩下的细胞数目少就索性不要了，反正想完全消化下来估计先下来的就损伤得太大了。特别是个别体积比较大的，有的消化20分钟左右都吹不下来。不知道你的是否这样。
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我也出现这样的情况 ，原代成纤维细胞状态很好 ，一 传代就死了很多很多 ，消化时一部分先下来，一部分贴的特别紧，好困扰！
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请问你们是做人的还是动物的心肌成纤维细胞？
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请问楼主取心脏后用什么酶消化吖？胰酶还是胶原酶吖？
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zxz91 但是细胞会有一部分变圆变亮了，另外一部分仍贴壁很牢，这样的话应该怎么办 我觉得跟用的胰酶也有关系，我们以前用的是不含EDTA的胰酶，效果效果就不好，很慢，而且有一部分已经漂了另外的还是形态很正常都没有变圆，后来换了含EDTA的胰酶，消化效果就好很多，还有就是每次都用新解冻的胰酶，上次用过的放4°的都不如新冻融的好用
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cheff0412 edited on
我想问一下，最后是如何解决这个问题的，我最近也遇到过类似问题，成纤维细胞在传代后出现大量细胞不贴壁，我的消化条件是：gibco的含edta的胰酶，100mm的培养皿，加入2ml胰酶，消化40s后吸弃胰酶，观察到越有60-70%的细胞皱缩，40s后90%细胞开始完全皱缩，然后使用完全培养基3ml中和，吹打尚未脱落的细胞；细胞离心5min后以1:2传，结果4小时后细胞贴壁不佳。求解决方法
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关于丁香园成纤维细胞培养要点有谁养过 我为什么我传几代形态就变了呢
关键是pH的稳定,及时换液,还要注意细胞密度,详细参考atcc.org上的信息.
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