百合无症病毒RT-PCR检测技术的研究--《甘肃农业大学》2005年硕士论文
百合无症病毒RT-PCR检测技术的研究
【摘要】：百合无症病毒(LSV)是全世界范围内为害百合的主要病毒病原,LSV经常与CMV、LMoV复合侵染导致百合叶片严重花叶和整株矮化,影响了百合的产量和商业价值,成为限制百合出口和切花出口的重要原因之一。目前,有关百合无症病毒病的快速检测在国内尚未见报道,因此对其进行研究,以及建立一套快速、准确的百合无症病毒检测技术,对搞清百合无症病毒病害的组培脱毒、有效防治、种苗检疫以及增加出口创汇将具有重要的现实意义。
本研究包括以下主要内容:运用血清学方法对LSV在我省百合作物上的侵染情况进行检测,了解其发生和复合侵染情况;通过电镜观察LSV 的粒子形态,以及内含体的有无及形态,为LSV的诊断提供依据;植物总RNA提取方法研究及LSV RT-PCR 优化检测体系的建立。
1. ELISA和电镜检测结果表明,我省百合主要受黄瓜花叶病毒(CMV-Li)和百合无症病毒(LSV)的侵染,并且两种病毒存在复合侵染现象。CMV-Li和LSV侵染率分别为40%和80%,复合侵染率为40%。对DAS-ELISA、I-ELISA 和DIBA-ELISA灵敏度比较试验结果表明,DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是I-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4 倍。ELISA田间结果检测结果表明,LSV的检出率是80.95%;百合不同部位带毒量测定结果表明,百合叶片的带毒量明显高于花和鳞茎。
2. 对经血清学检测带有LSV的百合病汁液和组织切片电镜观察发现,有短线状病毒粒子(593.29~639.97×12.15~14.12nm),确定为LSV,但没有发现内含体。
3. 以百合叶片和鳞茎为材料,对百合总RNA 提取方法进行了比较研究,结果表明Trizol法最适合于百合组织总RNA 的提取。
建立RT-PCR 的有效检测体系和优化检测体系。主要研究了RT 主要反应成分dNTPs、RNasin、引物、AMV、模板浓度及RT 时间对RT 反应的影响;PCR 主要反应成分dNTPs、Mg~(2+)、引物和Taq DNA聚合酶浓度对PCR反应的影响。结果表明:要获得良好的RT-PCR 扩增,RT 体系中dNTPs、RNasin、引物、AMV、模板浓度要达到0.4mmol/L、0.3U/μl 、0.4μmol/L、0.1U/μl、0.005μg/μl 以上;RT 时间不宜少于40PCR 体系中dNTPs 浓度至少要达到0.1mmol/L,在0.2mmol/L～0.3mmol/L 范围内可以获得最好地扩增效果;Taq E 浓度要达到0.015U/μl 以上;引物浓度不宜低于0.2μmol/L 但不宜高于0.7μmol/L;Mg2+要达到0.8mmol/L。以上各种成分用量的减少有效地降低了病毒检侧的成本。
【关键词】：
【学位授予单位】：甘肃农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2005【分类号】：S436.8【目录】：
第一章 文献综述9-16
1.1 百合及其病毒病种类10
1.2 百合无症病毒10-11
1.3 百合无症病毒诊断技术11-16
第二章 百合无症病毒的酶联免疫检测技术16-24
2.1 材料与方法16-19
2.1.1 毒源采集和保存16
2.1.2 百合病毒的ELISA测定16-19
2.2 结果与分析19-23
2.2.1 ELISA检测结果19-20
2.2.2 I-ELISA、DIBA-ELISA和DAS-ELISA检测LSV 灵敏度比较20-21
2.2.3 百合无症病毒的田间检测21-22
2.2.4 百合不同部位LSV带毒量测定22-23
2.3 讨论23-24
2.3.1 CMV 和LSV两种病毒复合侵染23
2.3.2 不同的判断方法将直接影响ELISA结果的准确性23
2.3.3 百合不同部位带毒量不同23
2.3.4 试验中应注意的问题23-24
第三章 百合无症病毒病原形态和寄主超微病变研究24-28
3.1 材料与方法24-26
3.1.1 供试材料24
3.1.2 病毒提纯24
3.1.3 病毒形态学与组织病变观察24-26
3.2 结果与分析26-27
3.2.1 百合无症病毒的田间症状26
3.2.2 病毒形态学观察结果26-27
3.3 讨论27-28
第四章 百合无症病毒的RT-PCR 检测体系的建立28-48
4.1 材料和方法28-32
4.1.1 供试材料28
4.1.2 供试药剂28
4.1.3 植物总RNA 的提取28-30
4.1.4 LSV 有效RT-PCR 体系的建立30-31
4.1.5 LSV RT-PCR 体系的优化31-32
4.1.6 IC-RT-PCR32
4.1.7 DAS-ELISA ,RT-PCR,IC-RT-PCR 的检测灵敏度的比较32
4.1.8 LSV的田间检测32
4.2 结果与分析32-43
4.2.1 RNA 提取的纯度和完整性分析32-33
4.2.2 从感病组织不同部位提取RNA 的比较33
4.2.3 总RNA RT-PCR 活性检测33-34
4.2.4 LSV RT-PCR 优化体系的建立34-35
4.2.5 LSV RT-PCR 体系的优化35-42
4.2.6 DAS-ELISA ,RT-PCR,IC-RT-PCR 的检测灵敏度的比较42
4.2.7 LSV的田间带毒情况检测42-43
4.3 讨论43-48
4.3.1 RNA 的提取方法的选择与注意事项43-44
4.3.2 RT-PCR 条件的选择与存在的问题44-46
4.3.3 DAS-ELISA ,RT-PCR,IC-RT-PCR 的检测灵敏度的比较46
4.3.4 RT-PCR 技术检测百合无症病毒的可靠性和灵敏度46-47
4.3.5 RT-PCR 技术的应用和推广47
4.3.6 进一步研究的设想47-48
主要结论48-49
参考文献50-55
附录1: 溶液配制55-57
作者简介57-58
导师简介58-59
独创性声明59
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All rights reserved&超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，ECl.15.1.1，简称SOD)是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶，它催化超氧阴离子自由基·O2-发生歧化反应，从而清除·O2-。有氧生物体在生物进化过程当中，相应地进化成一套行之有效的清除活性氧的保护网络。植物体内有效清除活性氧的酶促解毒系统包括SOD、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、脱氢抗坏血酸酶(DHAR)等。SOD作为植物抗氧化系统的第一道防线，清除细胞内过量的超氧阴离子自由基(·O2-)，它能催化植物体内分子氧活化的中间产物超氧物阴离子自由基的歧化反应，而生成氧分子和过氧化氢。生物体内的超氧阴离子(·O2-)是对体内重要生物大分子——脂类和蛋白质产生氧化和降解作用的一种有害物质，从而对细胞产生毒性。研究者于1938年首次从牛的血红细胞中分离出含铜离子的蛋白质(最初定名为血铜蛋白Hemocuprein)，并发现该蛋白有催化超氧阴离子自由基(·O2-)发生歧化反应的功能，因此命名为超氧化物歧化酶。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2&104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
改进的肾上腺素自氧化法测定植物SOD酶活性
一、&实验原理
超氧化物歧化酶(superoxide&dismutase，SOD)在生物体内广泛分布，能催化超氧阴离子自由基(O2-.)发生歧化反应，从而清除氧自由基，起到防御氧毒、抗辐射、抗衰老等作用。
目前因SOD来源不同测活方法非常多，但是所测酶活结果相差较大、活性单位也不统一。因此，本方法是针对植物型SOD对肾上腺素自氧化法的各种影响因素进行了研究,&建立一种微量、快速、稳定重复性好且适用于植物来源的S&O&D测定方法。
因植物来源的SOD成分比较复杂，且有微量的多酚抗氧化物成分。肾上腺素是多酚衍生物，在碱性条件下会自动氧化，其中涉及到(O2-.)的链式反应，可被SOD抑制，肾上腺素经多步转化为肾上腺素红。肾上腺素红有480&nm和320nm两个吸收峰。325&nm处的吸收更能灵敏地反映自氧化程度。当pH&10.2，线性范围缩短，pH值越高线性范围越小;pH&10.2&时吸光度值极小，易带入误差。pH10.2&维持着良好的线性段，而且斜率适中，可作为实际应用中的最佳pH。温度在30℃左右，线性关系较好。随着肾上腺素浓度的增加，自氧化速率增大，线性范围增加，当肾上腺素浓度为0.4&mmol/L使每1&min自氧化速率达0.070，提高了灵敏度、减少了误差。
二、&实验材料及用具
1、实验试剂
植物SOD样品(串叶松香草提取)1g、pH&7.5&质量浓度0.05mol/&L&的磷酸钠缓冲液、丙酮、0.4mmol/L肾上腺素溶液、50mmol/L&pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠、双蒸水、100mmol/L盐酸液，内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠
2、实验器具
试管30ml、WFZ&UV-2100&型紫外可见分光光度计、501A型超级数显恒温水浴、PHS-3C精密pH计
三、&实验步骤
1、配置溶液：配置pH&7.&5&质量浓度0.&05mol/L的磷酸钠缓冲液、50mmol/L&pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液及0.4mmol/L肾上腺素溶液(62:38);
2、植物SOD样液的制备。将植物SOD样品,加入pH7.5质量浓度0.05mol/L的磷酸钠缓冲液,于4℃条件下3500转/min&离心15min&,取酶液,加入-&20℃预冷丙酮,取沉淀物溶于少量重蒸水中,pH7.5、质量浓度25mmol/L的磷酸钠透析即得酶的粗提液。
3、将配置好的50mmol/L&pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液放到30℃±0.5℃水浴中保温20&
4、按照下表做实验组合对照组
肾上腺素自氧化法加样表：
50mmol/L&pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠
0.4mmol/L肾上腺素溶液
内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠
100mmol/L盐酸液
5将配置好的溶液分别放到325nm的分光光度计下测其吸光值，每隔1min记一次吸.............
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请教一下，0.4mmol/L的硼酸-氯化钾缓冲溶液（pH=8.5)怎么配置？谢谢！
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有人知道么？帮帮忙吧
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还要加氢氧化钠吧！0.4M硼酸溶液125ml,0.4m氯化钾溶液125ml,0.2M氢氧化钠溶液40ml，将上面三种溶液混合，用蒸馏水稀释到1000ml，PH=8.3
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ID：jaylin621
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要加NaOH的，否则根本不能达到预定的pH值。pH=8.0&
硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液 把25.0 ml 0.2 mol/L的硼酸-氯化钾与4.0 ml 0.1 mol/L NaOH 混合均匀，加水稀释至100 ml & pH=10.0& 硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液 把25.0 ml 0.2 mol/L 的硼酸-氯化钾与43.9 ml& 0.1 mol/L& NaOH混合均匀，加水稀释至100 mlpH=9.6 硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液 取硼酸12.37g与氯化钾14.91g，加水至1000ml，振摇使溶解，量取50ml，加氢氧化钾试液36.9ml，加水稀释成200ml，必要时，用1mol/L盐酸或氢氧化钾试液调节pH值至9.6pH=8.3 硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液 0.4M硼酸溶液125ml,0.4m氯化钾溶液125ml,0.2M氢氧化钠溶液40ml，将上面三种溶液混合，用蒸馏水稀释到1000ml，PH=8.3
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ID：suryliu
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谢谢大家！！！
eee9999eee
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ID：eee9999eee
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加氢氧化钠是调pH值，配制时一定要注意各溶液的浓度。
