关注今日：2 | 主题：207257
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
（请教）免疫荧光双标的具体步骤
页码直达：
这个帖子发布于11年零135天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位老师：免疫荧光双标中两个抗原都用间标法好还是一个用直标法一个用间标法好，具体步骤怎样，还需不需要像免疫组化那样要用H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂？我要观察免疫复合物（两种荧光的混合色）的分布的话是不是只能用激光共聚焦显微镜啊？一般的荧光显微镜可以吗？我在免疫荧光组织化学上还是个新手，请各位老师多多赐教，非常感谢！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
收起全部有料回复
这个你要参照一抗的说明书的。不存在什么一定的浓度比，其实就是取一定体积的2种一抗稀释在相同的抗体稀释液里，使得每一种一抗的浓度都是说明书推荐的最佳浓度。比如说抗体A 的最佳稀释度为1：50；抗体B的最佳稀释度为1：100，那么你可以取100微升的抗体稀释液，加2微升抗体A，再加1微升的抗体B，然后把配好的抗体混合液加到组织片上孵育。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园荣誉版主
1。直标法省钱，间标法贵，但是后者灵敏性更好。2。没有必要用H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂3。如果荧光强度足够强，一般荧光显微镜还是可以的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
非常感谢lits 间标法要求各种抗体来源于不同动物是吧，而且还可以以不同浓度比混合孵育，但是我不知道怎样的浓度比混合较合适，我查了相关文献没有具体说明这个浓度比。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
这个你要参照一抗的说明书的。不存在什么一定的浓度比，其实就是取一定体积的2种一抗稀释在相同的抗体稀释液里，使得每一种一抗的浓度都是说明书推荐的最佳浓度。比如说抗体A 的最佳稀释度为1：50；抗体B的最佳稀释度为1：100，那么你可以取100微升的抗体稀释液，加2微升抗体A，再加1微升的抗体B，然后把配好的抗体混合液加到组织片上孵育。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢joanna 老师，我明白了！那冲洗的缓冲液用PBS好还是TBS好。我在一篇文献上看到作者在做免疫荧光双标时其中一个指标的标记方法是：加完一抗孵育后，加生物素化二抗孵育，然后加Avidin标记的荧光素（Texas Red），这是不是像免疫组化的三步法一样，可以增加其敏感性啊？还有他在加一抗前用3mol/L的尿素室温孵育30min是何用途，类似于H2O2的作用吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
参谋长 谢谢joanna 老师，我明白了！那冲洗的缓冲液用PBS好还是TBS好。我在一篇文献上看到作者在做免疫荧光双标时其中一个指标的标记方法是：加完一抗孵育后，加生物素化二抗孵育，然后加Avidin标记的荧光素（Texas Red），这是不是像免疫组化的三步法一样，可以增加其敏感性啊？还有他在加一抗前用3mol/L的尿素室温孵育30min是何用途，类似于H2O2的作用吗？用PBS还是TBS没什么太大差别。如果你的抗体稀释液是用TBS配的话，那不妨就用TBS冲洗。对，上述的步骤就是为了增加敏感性。尿素与H2O2的作用应该是不同的。H2O2主要是为了消除内源性过氧化物酶的活性；而尿素是为了暴露抗原。——抗原修复 由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲键等封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽，因此在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复，需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理 / 化学方法。——化学方法：主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
真的是太感谢joanna 老师您了，我又学到了好多东西！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
lits 1。直标法省钱，间标法贵，但是后者灵敏性更好。2。没有必要用H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂3。如果荧光强度足够强，一般荧光显微镜还是可以的如果一般荧光显微镜看不到，共聚焦更看不到，因为共聚焦的激发能力较弱！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
各位老师：我又碰到了个问题，我做免疫荧光双标的两个一抗找不到异种动物的，都只有小鼠单克隆抗体，可我又想做间标法（非洗脱法），不知如何是好。请问各位老师有谁见过HBsAg和CD16的其他动物来源的一抗啊？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
是啊，要是两个一抗只能是同一来源，同一型的，做免疫荧光染色，该怎么办啊
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你仔细搜一下贴子 ，两个一抗是同一来源的中间阻断一下就可以了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你仔细搜一下贴子 ，两个一抗是同一来源的中间阻断一下就可以了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我见有本书上介绍一种洗脱法，似乎两种抗体可以是同种来源的，但是步骤好麻烦，唉，实在没办法弄到异种动物一抗也只能试试了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请教，做细胞免疫荧光时，一种荧光染料如Cy3在绿色和红色荧光波段，均产生很强的荧光。不知是自发荧光还是二抗不好，我用的是Jackson 的二抗，大家都用得挺好。不知道什么原因，有没有高手有这方面的经验。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
joanna 这个你要参照一抗的说明书的。不存在什么一定的浓度比，其实就是取一定体积的2种一抗稀释在相同的抗体稀释液里，使得每一种一抗的浓度都是说明书推荐的最佳浓度。比如说抗体A 的最佳稀释度为1：50；抗体B的最佳稀释度为1：100，那么你可以取100微升的抗体稀释液，加2微升抗体A，再加1微升的抗体B，然后把配好的抗体混合液加到组织片上孵育。请问这两种一抗的二抗也可以这样混合孵育吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请教各位老师：我想做牙齿的荧光双标，以前没做过免疫方面的实验，由于组织特殊性（没有细胞，矿物质内含有的有机物90%是胶原纤维，酸处理表面可以出来15μm的脱矿层），只要求把两种不同的荧光连上去就行，用共聚焦观察。两个一抗都是小鼠的，只不过一个是IgG，一个是IgM，应该可以的吧？二抗抗IgG的国产的，抗IgM的国产抗体特别少，有谁能推荐个好的公司的不？SouthernBiotech的抗体怎么样？敬请指导
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
还有，酸处理后的胶原网络容易塌陷，要求能够保持蓬松的状态，用什么固定液比较好，还能保证抗原结合位点不破坏？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园免疫荧光双标失败分析(免疫荧光,一抗,免疫组化,孵育) - 免疫实验 - 生物秀
标题: 免疫荧光双标失败分析(免疫荧光,一抗,免疫组化,孵育)
摘要: [免疫荧光双标失败分析(免疫荧光,一抗,免疫组化,孵育)] 我今天做了免疫荧光双标染色，但是荧光显微镜下两种不同激发光下观察，背景非常高，都看不出阳性表达了。大家帮我分析一下，问题出在哪里？我的步骤如下：1、石蜡切片脱蜡水化抗原修复，PBS洗。2、3%H2O2室温10分钟以灭活内源性过氧化物酶，PBS浸泡洗涤5分钟，3次。3、正常羊血清工作液封闭半小时，不洗，吸干组织周围液体。4、滴加两种一抗混合液，（分别为免抗desmin和鼠抗a-SMA），37度孵育1 关键词:[免疫荧光 一抗 孵育 免疫组化 荧光显微镜 阳性 石蜡切片]……
我今天做了免疫荧光双标染色，但是荧光显微镜下两种不同激发光下观察，背景非常高，都看不出阳性表达了。大家帮我分析一下，问题出在哪里？我的步骤如下：1、石蜡切片脱蜡水化抗原修复，PBS洗。2、3%H2O2室温10分钟以灭活内源性过氧化物酶，PBS浸泡洗涤5分钟，3次。3、正常羊血清工作液封闭半小时，不洗，吸干组织周围液体。4、滴加两种一抗混合液，（分别为免抗desmin和鼠抗a-SMA），37度孵育1小时，PBS洗3次。（两种一抗工作液浓度采用在各自的免疫组化单标记时的工作液浓度）。5、滴加两种二抗混合液，（分别是羊抗兔FITC及羊抗鼠Cy3）避光，孵育1小时，PBS洗3次。6、荧光显微镜下观察。镜下分别看到黄乎乎和红乎乎的一片，都分不清阳性阴性啦，问题出来哪里？是不是一抗浓度过高？做免疫荧光的抗体稀释浓度应该低于免疫组化的吧？还请各位指教！
回复没人应助呀？回复我的经验：一抗：4度，24h孵育PBS洗3min，洗三次二抗：先加一种二抗（选两种二抗中略差的那个），室温，孵育45min，用PBS洗一次，3min再加第二种二抗，室温，孵育45min，用PBS洗3次，每次3min用Hoechest 染2分钟，PBS洗2次，H2O洗一次。50%甘油封片。镜下观察。Tip：1,第一个二抗结束后不要洗3次，否则洗的次数过多，可能导致第一个二抗显色不好2,可以不用H2O23,如果是胞浆染色，用0.25%PBST通透10-20分钟4,Hoechest染色有助于寻找细胞层面，及进行。5，因为荧光染色缺少放大效应，所以滴度不应低于DAB显色的滴度，做的时候从1:100做起。二抗1:100-1:200回复补充：你的结果不是背景太高吧，可能是阳性的太弱了。所以显微镜会调整到模糊，对比度很差。回复PBST是啥呀?接在哪一步后进行通透呀?回复对不起，没有写清楚，PBST为简写，其实是0.3%Triton-100 PBS（0.01M)回复对不起，没有写清楚，PBST为简写，其实是0.3%Triton-100 PBS（0.01M)通透在加封闭液之前。最好也用PBST稀释，这样可以增加吸附作用。就不用PBST稀释了。回复做免疫荧光最好是要用冰冻切片,石蜡的估计抗原破坏的较多.不妨试试!回复做免疫荧光最好是要用冰冻切片,石蜡的估计抗原破坏的较多.不妨试试!回复做免疫荧光最好是要用冰冻切片,石蜡的估计抗原破坏的较多.不妨试试!回复我也遇到相同的情况，楼主解决问题没？？回复我现在常规免疫组化法分别进行单标，两种抗原都能显色，背景也很清楚。但是再用同样的一抗浓度分别进行免疫荧光单标，有一种抗原就是做不出来，换用冰冻切片也是同样结果！为何组化能做出来，荧光却做不出来呢？我都换了两次了，还是不行，一抗我都过夜了，二抗也延长到室温2小时，还是不行。可别人用我的二抗能做出来呀！请各位指点！回复你有没有提高一抗的滴度然后再做呢，因为DAB相关的ABC显色有放大作用，而免疫荧光则没有。你提高一抗到1:100，然后再试试看。回复2、3%H2O2室温10分钟以灭活内源性过氧化物酶，PBS浸泡洗涤5分钟，3次。这步可省因为你做荧光，内原酶无关
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-关注今日：2 | 主题：207257
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】求关于神经元和神经胶质细胞免疫荧光双标的方法
页码直达：
这个帖子发布于5年零311天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近在做神经元干细胞分化后的神经元和神经胶质细胞的鉴定，做了简单的细胞免疫组织化学，但是还是不能具体说明问题，想进一步做免疫荧光双标的鉴定，不知道哪位有这方面的资料可以借来共享下，先谢谢了！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
单染安全，尤其对初学者。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
lichenyu0913 我最近在做神经元干细胞分化后的神经元和神经胶质细胞的鉴定，做了简单的细胞免疫组织化学，但是还是不能具体说明问题，想进一步做免疫荧光双标的鉴定，不知道哪位有这方面的资料可以借来共享下，先谢谢了！帮助分析一下，希望对你有用，供你参考：你的目的是想通过免疫组织化学的办法鉴定培养的细胞是神经元 还是 神经胶质。你已经做过的是 细胞免疫组化，不过这个说的不具体，对下面的分析，造成了一定的阻碍。现在假设：你做的细胞免疫组化是 单标记的，也就是说你有 鉴定神经元的抗体 和鉴定神经胶质细胞的抗体，并且做出了结果。那么如果下一步要进行细胞的免疫荧光双标。第一步：保证两个抗体不能够来自同一个种属，比如不能都是小鼠抗，或者都是兔抗的等等。如果是同一种属来源的，那么需要更换抗体。第二部：这两个抗体要都能用用于免疫荧光，不过一般来讲，能够用于免疫组化的一抗，一般都能进行免疫银光的染色，但是也有例外，所以要进一步确定。如果不用用于免疫荧光，需要更换抗体。第三部：双标的方法简单的说包括顺序法（先染一个抗体，再染第二个）和平行法（两个一抗同时加，两个尔康同时加）。前者是公认的最佳操作办法，但是有一个弊端就是你的片子上的细胞要足够牢靠，不掉片，因为这个方法过程长，反复过水很容易掉片；第二种方法，在我看来，虽然不是最佳，但是很方便，我就是这样染色的，但是有时候可能会出现背景高，图片不漂亮等。但是这个问题的解决我个人觉得还是在抗体上，如果抗体给力，无论哪一种方法都有好结果。第四部，在做第三部的同时，一定要做好第四部即各种对照，这里主要说的是交叉对照，和空白对照，即神经元的一抗和神经胶质的二抗相匹配，神经胶质的一抗和神经元的二抗相匹配，两个二抗单独匹配，结果都要是阴性。这一点很重要的。第5步，为了进一步的保证结果的真实性，建议用两个或两个以上公司的抗体，或者一个公司，但是是不同批号的抗体。最后，鉴于楼主的是神经元和神经胶质的鉴别，在选择抗体尤其是胶质细胞抗体的时候要注意，比如GFAP，只星形胶质细胞的，S100好像是小胶质细胞（记不清了），也就是说要保证抗体的特异性，也好为图片分析做准备。good luck！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢楼上的兄弟
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：3 | 主题：134907
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】免疫荧光双标图片
页码直达：
丁香园准中级站友
这个帖子发布于7年零203天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
这是一篇文献上的免疫荧光双标图片，左边的两张是A/B的双标，右边的两张是A/C的双标，我有个疑问：1作者是怎样将红色和绿色的阳性细胞整合到一张图片上？2从图上看细胞的位置没有变，也就是说这出自于一张切片，难道一张组织片可以做两个不同的双标吗？请先者解答，谢谢！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
收起全部有料回复
无论是用普通的荧光显微镜还是激光共聚焦显微镜，都应该是分别拍摄两种颜色的荧光照片，然后合成为一张彩色照片。专业的作法是先分别在不同滤光片下拍摄单色照片，然后用图像分析软件加上伪彩色合成。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
一张片子可以双染,在同一个视野下,变换激发波长可以得到&细胞位置没有改变的&效果了.个人认为图片是可以在真实的前提下做一定的处理的...
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不知道楼上的和楼上的了解过量子点没，用不同粒径的量子点分别标记在蛋白或者细胞的不同位点，用同一种光照射是可以很easy的实现一元激发多元发射的... ...我非专业，说的不对请见谅！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
这个还真不知道，感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
荧光显微镜只能一次拍一个标记，然后对照片进行整合
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
激光共聚焦？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
krisfine 荧光显微镜只能一次拍一个标记，然后对照片进行整合整合后的图片(merged file)与共聚焦显微镜二次曝光拍的照片有什么区别？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
无论是用普通的荧光显微镜还是激光共聚焦显微镜，都应该是分别拍摄两种颜色的荧光照片，然后合成为一张彩色照片。专业的作法是先分别在不同滤光片下拍摄单色照片，然后用图像分析软件加上伪彩色合成。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
同意楼上，ABC是不同波长的二抗，拍左边时只扫描AB，赋予A红色，B绿色；拍右边时只扫AC，赋予A红色，C绿色
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
可能很多人还不太清楚量子点，以下是简单的介绍！量子点（quantum dots .QDs）是指纳米尺寸的半导体微粒又称半导体纳米晶体 ，是一类由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、尺寸在 2~20nm之间的纳米晶体。目前研究较多的是CdX（X=S,Se,Te），生物标记中常用的是CdSe。与传统有机荧光分子相比，量子点的激发光谱宽而连续，而发射光谱狭窄且谱峰为对称高斯分布；其荧光发射波长可通过改变自身的尺寸和组成进行调节，从而可以实现一元激发多元发射的同时标记，使生物分子的多组分同时检测成为可能；量子点还具有光稳定性强、耐光漂白的特性，可以经受多次的激发；此外，量子点能抵抗生物活体内的代谢降解作用，几乎无细胞毒性，在活体内及细胞内长时间存在，不会对实验动物及细胞造成很大的伤害。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
再上一张图，baidu上搜的现在不知道量子点就有点落后啦，哈哈！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
hbchendl战友的意思是普通荧光显微镜合并的双标图片与共聚焦拍的图片原理是一样的，那么共聚焦到底有什么优势呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
灵敏度高呀。很多情况下在普通荧光显微镜看不到的荧光能用激光共聚焦显微镜拍摄到。另外激光共聚焦是扫描式成像，还可以进行一些特殊的拍摄。功能扩展很多的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我就是个业务 再上一张图，baidu上搜的现在不知道量子点就有点落后啦，哈哈！第一次听说这个，汗。看来得不断学习呀。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
先分别拍单张，再用软件合成的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
有些组织切片比较厚，比如冰冻切片20-50um，如果两个细胞不再同一个平面，但是刚好在一条垂直线上，这样叠加的时候不就出现&colocalization&的假阳性？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
共聚焦相当于给细胞做CT，断层扫描，清晰灵敏度高，而且可以看到亚细胞结构。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
krisfine 荧光显微镜只能一次拍一个标记，然后对照片进行整合整合后的图片(merged file)与共聚焦显微镜二次曝光拍的照片有什么区别？同问，终于找到答案了，谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园（请问）免疫荧光双标的具体步骤(免疫荧光,免疫组化,过氧化物酶,免疫复合物) - 免疫实验 - 生物秀
标题: （请问）免疫荧光双标的具体步骤(免疫荧光,免疫组化,过氧化物酶,免疫复合物)
摘要: [（请问）免疫荧光双标的具体步骤(免疫荧光,免疫组化,过氧化物酶,免疫复合物)] 请教各位老师：免疫荧光双标中两个抗原都用间标法好还是一个用直标法一个用间标法好，具体步骤怎样，还需不需要像免疫组化那样要用H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂？我要观察免疫复合物（两种荧光的混合色）的分布的话是不是只能用激光共聚焦显微镜啊？一般的荧光显微镜可以吗？我在免疫荧光组织化学上还是个新手，请各位老师多多赐教，非常感谢！ 关键词:[免疫荧光 过氧化物酶 免疫复合物 免疫组化 抗原 激光共聚焦显微镜 荧光显微镜]……
请教各位老师：免疫荧光双标中两个抗原都用间标法好还是一个用直标法一个用间标法好，具体步骤怎样，还需不需要像免疫组化那样要用H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂？我要观察免疫复合物（两种荧光的混合色）的分布的话是不是只能用激光共聚焦显微镜啊？一般的荧光显微镜可以吗？我在免疫荧光组织化学上还是个新手，请各位老师多多赐教，非常感谢！
回复1。直标法省钱，间标法贵，但是后者灵敏性更好。2。没有必要用H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂3。如果荧光强度足够强，一般荧光显微镜还是可以的回复非常感谢lits 间标法要求各种抗体来源于不同动物是吧，而且还可以以不同浓度比混合孵育，但是我不知道怎样的浓度比混合较合适，我查了相关文献没有具体说明这个浓度比。回复这个你要参照一抗的说明书的。不存在什么一定的浓度比，其实就是取一定体积的2种一抗稀释在相同的抗体稀释液里，使得每一种一抗的浓度都是说明书推荐的最佳浓度。比如说抗体A 的最佳稀释度为1：50；抗体B的最佳稀释度为1：100，那么你可以取100微升的抗体稀释液，加2微升抗体A，再加1微升的抗体B，然后把配好的抗体混合液加到组织片上孵育。回复谢谢joanna 老师，我明白了！那冲洗的缓冲液用PBS好还是TBS好。我在一篇文献上看到作者在做免疫荧光双标时其中一个指标的标记方法是：加完一抗孵育后，加素化二抗孵育，然后加Avidin标记的荧光素（Texas Red），这是不是像免疫组化的三步法一样，可以增加其敏感性啊？还有他在加一抗前用3mol/L的尿素室温孵育30min是何用途，类似于H2O2的作用吗？回复谢谢joanna 老师，我明白了！那冲洗的缓冲液用PBS好还是TBS好。我在一篇文献上看到作者在做免疫荧光双标时其中一个指标的标记方法是：加完一抗孵育后，加素化二抗孵育，然后加Avidin标记的荧光素（Texas Red），这是不是像免疫组化的三步法一样，可以增加其敏感性啊？还有他在加一抗前用3mol/L的尿素室温孵育30min是何用途，类似于H2O2的作用吗？用PBS还是TBS没什么太大差别。如果你的抗体稀释液是用TBS配的话，那不妨就用TBS冲洗。对，上述的步骤就是为了增加敏感性。尿素与H2O2的作用应该是不同的。H2O2主要是为了消除内源性过氧化物酶的活性；而尿素是为了暴露抗原。——抗原修复 由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲键等封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽，因此在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复，需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理 / 化学方法。——化学方法：主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。回复真的是太感谢joanna 老师您了，我又学到了好多东西！回复1。直标法省钱，间标法贵，但是后者灵敏性更好。2。没有必要用H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂3。如果荧光强度足够强，一般还是可以的如果一般看不到，共聚焦更看不到，因为共聚焦的激发能力较弱！回复各位老师：我又碰到了个问题，我做免疫荧光双标的两个一抗找不到异种动物的，都只有小鼠单克隆抗体，可我又想做间标法（非洗脱法），不知如何是好。请问各位老师有谁见过HBsAg和CD16的其他动物来源的一抗啊？回复是啊，要是两个一抗只能是同一来源，同一型的，做免疫荧光染色，该怎么办啊回复你仔细搜一下贴子 ，两个一抗是同一来源的中间阻断一下就可以了回复你仔细搜一下贴子 ，两个一抗是同一来源的中间阻断一下就可以了回复我见有本书上介绍一种洗脱法，似乎两种抗体可以是同种来源的，但是步骤好麻烦，唉，实在没办法弄到异种动物一抗也只能试试了。回复请教，做细胞免疫荧光时，一种如Cy3在绿色和红色荧光波段，均产生很强的荧光。不知是自发荧光还是二抗不好，我用的是Jackson 的二抗，大家都用得挺好。不知道什么原因，有没有高手有这方面的经验。回复这个你要参照一抗的说明书的。不存在什么一定的浓度比，其实就是取一定体积的2种一抗稀释在相同的稀释液里，使得每一种一抗的浓度都是说明书推荐的最佳浓度。比如说A 的最佳稀释度为1：50；抗体B的最佳稀释度为1：100，那么你可以取100微升的抗体稀释液，加2微升抗体A，再加1微升的抗体B，然后把配好的抗体混合液加到组织片上孵育。请问这两种一抗的也可以这样混合孵育吗？回复请教各位老师：我想做牙齿的荧光双标，以前没做过免疫方面的实验，由于组织特殊性（没有细胞，矿物质内含有的有机物90%是胶原纤维，酸处理表面可以出来15μm的脱矿层），只要求把两种不同的荧光连上去就行，用共聚焦观察。两个一抗都是小鼠的，只不过一个是IgG，一个是IgM，应该可以的吧？抗IgG的国产的，抗IgM的国产抗体特别少，有谁能推荐个好的公司的不？SouthernBiotech的抗体怎么样？敬请指导回复还有，酸处理后的胶原网络容易塌陷，要求能够保持蓬松的状态，用什么固定液比较好，还能保证抗原结合位点不破坏？
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-