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关于细胞迁移实验transwell使用的一些操作问题
我最近要做某种蛋白的趋化性试验，由于之前没有做过，所以在实验设计上查了不少资料，也参考了小木虫上的挺多经验，自己做了个实验设计，准备这两天做，但还有挺多细节不太明确，所以上来发一下我的实验步骤和设计，请教大家一些细节上的问题，也和做过的网友们交流一下。
我买的是Corning#3422 transwell，用的细胞是SD大白鼠的间充质干细胞。
根据查得的资料（包括transwell说明书，corning官网的指南，网上下的操作说明以及论坛上的交流总结）我把实验步骤简单总结如下：
1. MSC铺满培养瓶底80%左右时，换无血清培基，饥饿处理24h。【此处培基需要加0.5%BSA吗？】
2. 胰酶消化细胞，用无血清培基（含0.5%BSA）中止消化并稀释得细胞悬液（10万/ml）。
3. 100ul细胞悬液接种至上室，600ul 10%FBS的培基加入下室。【这个顺序对吗？还是应该先加下室？还是无所谓？】【干细胞的接种量多少比较合适？我这里是按照一般的24孔板用1万/孔可以吗？还有一般需要至少几个平行孔？transwell孔板比较贵，在保证尽量准确的情况下最少设2个平行样行吗？】
4. 孵育一定时间。【我的干细胞在培养瓶里时一般4小时左右就能贴壁，8小时基本完全铺展，那么做迁移测试的时候应该放多长时间呢？】
& & (1) 用棉签擦去上室细胞。【这里我很不明确啊，我下载的官网说明只说“除去上室细胞”，网上网友大多都说用棉签擦掉，用的是一般的那种医用棉签？具体怎么擦？这样擦对下室细胞没影响么？】
& & (2) 染色用显微镜拍照和计数或MTT法测OD值计数。【是不是细胞比较多的时候测OD值更准确？如果我又想拍照又想测得比较准又不想设置太多孔平行样是不是可以用结晶紫染色后洗脱测一次OD值然后再次染色拍照？】
我的实验设计：
预实验：以不同接种数量和不同孵育时间试验找到最优条件。
实验：无血清培基（含0.5%BSA）中加入不同浓度待测蛋白作为下室培基进行实验，测该蛋白的dose-dependence，无血清培基（含0.5%BSA）作为空白对照，10%FBS培基作为正对照。
以上是我的实验设计，方括号里的是我的一些问题想请教大家......因为我还没开始做所以问题有点多......有做过或者准备做迁移实验的人一起来交流一下吧！
P.S. 我本身是材料专业做生物材料的，跨学科很多生物的东西都还在学，如果有的问题比较低级的话还请大家见谅和耐心赐教呢:)
非常感谢。干细胞铺展面积比较大所以我们平时接一般的24孔板都是1-5万没孔，接到10万的话状态就不太好了，做transwell的话我也要在摸索一下。
你做的肿瘤细胞贴壁的吗？能告诉我你的细胞在培养瓶里的大致贴壁时间和你做transwell时的孵育时间我参考一下吗？
再次超级感谢哈！
恩恩，还在做的，我做的时候也是这么弄棉签的^_^感谢交流哦～
我只做迁移实验，不做侵袭的……
不知道楼主还做吗？我想问一下，观察的时候，把上面的细胞用棉签擦掉，是观察膜的下面吗？还是观察上面？
不知道您这个问题解决了吗？ 我试验中也出现了一模一样的问题，如果解决了能不能告诉我一下具体的细节操作，做迁移的话您的细胞量是每孔10万吗？还是更多？
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Caco-2细胞接种在Transwell里面，跨膜电阻抗TEER值上不去，是什么原因呢？
养过Caco-2的大侠：我用的是Corning的Transwell12孔培养板（货号3460），直径12mm，孔径0.4um。在嵌套小室里面以4.8×10^5/ml接种细胞（每孔接种0.5ml细胞悬液），培养基DMEM：FBS：双抗=45ml:5ml:0.5ml。空白值：上下两室均用这种完全培养基，不接细胞，上室0.5ml，下室1.5ml，电阻值120-140Ω（空白值上下两室盛装培养基测量而得，并没有换成PBS或者HBSS，不知道行吗？）而接种细胞的孔也是直接测量，未用PBS清洗，也未换成PBS再测（因为空白孔就是用的完全培养液），结果两周过去了，其电阻值仍与空白电阻值大小差不多，均为120~140Ω。请问：正确的测量方法是什么？难道是把上下两室培养液移走，换成PBS测量，测毕，再换回培养液培养嘛？为什么我的细胞跨膜电阻抗值（TEER）上不去？原因是什么？我确定Transwell嵌套小室里面的细胞还活着，因为空白孔的培养液是红色的，而接有细胞的小孔换液后第二天可见其颜色明显变浅，偏黄，说明细胞代谢了吧~
那就一起边实验边探讨吧~
我确定细胞还活着~而且肯定早都长满了，因为肉眼可见白蒙蒙的一层膜。与对照组透明的相比很容易区分~“第9天，才100多”，那么减去空调白值，应该也是零左右吧？
我现在又复苏了一管细胞，打算传三代之后，再分三个浓度接种：2.4, 4.8, 9.6乘以10^5/孔，每个浓度接三孔，看看情况。。。
我的也是一样的问题，好啊，一起探讨吧~
还在Transwell里面养着，打算再接种两版看看电阻的情况。你呢？也做这个吗》TEER值怎么样？
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扫描下载送金币我要做侵袭实验,瞬时转染后多长时间,可进行消化细胞transwell小室的细胞接种?我要做侵袭实验,但我做的是瞬时转染的贴壁细胞,瞬时转染后多长时间,可以消化细胞进行transwell小室的细胞接种?该问题已被收录到“细胞培养”专题
低调_路过8783
博凌科为生物科技-为你最好是24小时,我们科有两个都用二十四小时,但也有文献报道说用48小时.如果是稳定转染,则需要在对数生长期接种细胞.
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【求助】transwell共培养
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这个帖子发布于3年零22天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位战友,鄙人最近准备做一个transwell共培养实验,即2种细胞非接触共培养,观察一种细胞对另一种细胞的影响.但是两种细胞的培养液不同,不知该如何处理?transwell共培养时,2种细胞的培养液需要相同吗?若观察A细胞对B细胞的影响是将A细胞接种于下室,B细胞接种于上室吗?望各位战友不吝赐教!谢谢!
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若是六孔板 下室1ml培养基 即可哪种细胞种在上面 就要看你的实验设计 包括实验目的
比如说 你要看下层对上层细胞迁移的影响 还有就是 若你主要收集A细胞 那么就种在下室吧关于培养基问题 需要看下 A B 细胞平时里用的什么培养基了
能统一最好统一吧 不一样的话 可以接种前换成一样的也行关于Transwell insert 还是建议采用康宁的吧 PET 材料的
透光度好 在显微镜下 A B细胞都能看到 便于观察共培养后形态的变化 这是优点另外 Transwell insert 还可以重复利用0.4μm的孔径大小 细胞穿不过的 细胞因子是能通过的
但是需要一定是平衡时间才能达到上下室一样浓度 5μm 8μm孔径大小的可以用于部分细胞的迁移实验，选择取决于细胞的体积大小
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做共培养，两种培养基最好一致，最差也要找个折中方案，或者控制培养时间，使不同的培养基不至于产生额外影响；另外，你想看A对B的影响，把B放在上室，收集起来很麻烦，面积也不够大；不知道你看到过共培养小室没有，再好的小室也不是全透明的，放在上室的细胞观察和照相都不如下室。理论上上下室细胞因子可以自由扩散的话，还是把效应细胞放在下室吧。
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最好把细胞名称说出来，是做诱导分化？
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yelan 各位战友,鄙人最近准备做一个transwell共培养实验,即2种细胞非接触共培养,观察一种细胞对另一种细胞的影响.但是两种细胞的培养液不同,不知该如何处理?transwell共培养时,2种细胞的培养液需要相同吗?若观察A细胞对B细胞的影响是将A细胞接种于下室,B细胞接种于上室吗?望各位战友不吝赐教!谢谢!培养液不同可以共培养：下室培养基的量不用太多，刚好接触膜即可。接种方式也是对的；A下，B上；买Transwell的时候注意买共培养的小室，而不是侵袭等的小室
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若是六孔板 下室1ml培养基 即可哪种细胞种在上面 就要看你的实验设计 包括实验目的
比如说 你要看下层对上层细胞迁移的影响 还有就是 若你主要收集A细胞 那么就种在下室吧关于培养基问题 需要看下 A B 细胞平时里用的什么培养基了
能统一最好统一吧 不一样的话 可以接种前换成一样的也行关于Transwell insert 还是建议采用康宁的吧 PET 材料的
透光度好 在显微镜下 A B细胞都能看到 便于观察共培养后形态的变化 这是优点另外 Transwell insert 还可以重复利用0.4μm的孔径大小 细胞穿不过的 细胞因子是能通过的
但是需要一定是平衡时间才能达到上下室一样浓度 5μm 8μm孔径大小的可以用于部分细胞的迁移实验，选择取决于细胞的体积大小
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做共培养，两种培养基最好一致，最差也要找个折中方案，或者控制培养时间，使不同的培养基不至于产生额外影响；另外，你想看A对B的影响，把B放在上室，收集起来很麻烦，面积也不够大；不知道你看到过共培养小室没有，再好的小室也不是全透明的，放在上室的细胞观察和照相都不如下室。理论上上下室细胞因子可以自由扩散的话，还是把效应细胞放在下室吧。
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谢谢各位的答疑！我还有个问题：这个共培养体系我要观察1周左右，但是这2种细胞3至4就需要传代，而且传代的时间不一定一致，我既要连续观察2种细胞的变化又要传代，这该如何解决呢？此外，上室细胞该如何传代，和普通传代一样吗？
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yelan 谢谢各位的答疑！我还有个问题：这个共培养体系我要观察1周左右，但是这2种细胞3至4就需要传代，而且传代的时间不一定一致，我既要连续观察2种细胞的变化又要传代，这该如何解决呢？此外，上室细胞该如何传代，和普通传代一样吗？我自己做的实验中Transwell是没有传代的，感觉传代对细胞影响很大。
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如果不传代，观察时间又比较久超过传代时间，您是怎么处理的呢？是换成无血清培养基，使细胞停止分裂增殖吗？
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楼主，你好，我也打算做两种细胞的共培养，研究PMN的迁移，想问一下你是如何检测迁移的，是测TEER值吗
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我也是做transwell共培养，跟楼主有同样的问题，急求解决啊？？？
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yelan 谢谢各位的答疑！我还有个问题：这个共培养体系我要观察1周左右，但是这2种细胞3至4就需要传代，而且传代的时间不一定一致，我既要连续观察2种细胞的变化又要传代，这该如何解决呢？此外，上室细胞该如何传代，和普通传代一样吗？ 最近做实验遇到跟楼主一样的问题，请问您最终找到合适的方法了吗，非常感谢，新春愉快~
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安静的眼睛
最近做实验遇到跟楼主一样的问题，请问您最终找到合适的方法了吗，非常感谢，新春愉快~ 请问解决了吗？
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上下室均可传代，但最好计算一下传代时间，能一致最好，着要根据自己的经验了。我用的康宁的Transwell培养板，上室细胞用胰酶消化没问题，但要小心吹打
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yelan 上下室均可传代，但最好计算一下传代时间，能一致最好，着要根据自己的经验了。我用的康宁的Transwell培养板，上室细胞用胰酶消化没问题，但要小心吹打您好，我想请问一下，共培养时，一般下室放多少培养液？上室放多少培养液呢？
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yelan 如果不传代，观察时间又比较久超过传代时间，您是怎么处理的呢？是换成无血清培养基，使细胞停止分裂增殖吗？ 我自己的实验是控制在传代时间内的
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yaorongrong7 您好，我想请问一下，共培养时，一般下室放多少培养液？上室放多少培养液呢？ 下室放2.6，上室1.6，这是说明书推荐的，但是我觉得下室2，上室1也可以，只要保证液面相同
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yelan 上下室均可传代，但最好计算一下传代时间，能一致最好，着要根据自己的经验了。我用的康宁的Transwell培养板，上室细胞用胰酶消化没问题，但要小心吹打 还想补充一点，传代一定要轻柔，产生的细胞碎片和其他损伤相关的因子都会影响你的实验，可能要摸索一段时间条件
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cheff0412 edited on
你最后两种细胞的培养液是怎么折中的呢？我是想把骨髓间充质干细胞和脐静脉内皮细胞间接共同培养
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defead 最好把细胞名称说出来，是做诱导分化？ 你有没有用transwell做过诱导分化呢？最近打算用，还在查文献，希望的到您的建议,谢谢！
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请问，细菌和细胞共培养用transwell可行吗？观察细菌分泌物质对细胞的影响，细菌是在上室还是下室呢？细菌培养还是用细菌的培养基吗？可以换成细胞用的培养基吗
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目前实验已经结束，结果还可以。这2种细胞非接触共培养，培养液我选择了其中一种，原则是依据对培养液要求高的细胞而选择，同时保证此种培养液对另一种细胞生长基本无影响。共培养过程中由于要检测培养液中因子变化，培养液不宜过多，上下层接触即可，但是由于培养箱内温度影响，培养液会蒸发一部分，故应考虑这部分损失，因而预实验很重要，transwell小室不便宜（300元左右一个吧，记不清了）。细菌和细胞的共培养没做过，若是观察细菌对细胞的影响，还是将细胞放在下室，方面观察和实验后期处理，具体问题还请战友参阅相关文献。
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恭喜楼主试验结束，鄙人目前也在做这方面的内容，想问下楼主以你的经验，6孔板上下室的培养液最好分别是多少呢？种到小室的细胞是直接计数种进去还是先在另外一块6孔板的小室种下，然后稳定一天后再将小室移入到共培养的环境中呢？然后想问下培养液中的因子楼主是用什么方法检测的？多谢！
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共培养是用ELISA检测培养液中的因子，所以为了保证上清液中细胞因子浓度，培养体系适当减少，6孔transwell小室中下室用的1ml,上室0.6ml，由于在培养箱内培养液有少许蒸发，具体用量最好根据根据预实验调整。共培养时机是上下室细胞分别贴壁后移至一起。
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wangyx520 若是六孔板 下室1ml培养基 即可哪种细胞种在上面 就要看你的实验设计 包括实验目的
比如说 你要看下层对上层细胞迁移的影响 还有就是 若你主要收集A细胞 那么就种在下室吧关于培养基问题 需要看下 A B 细胞平时里用的什么培养基了
能统一最好统一吧 不一样的话 可以接种前换成一样的也行关于Transwell insert 还是建议采用康宁的吧 PET 材料的
透光度好 在显微镜下 A B细胞都能看到 便于观察共培养后形态的变化 这是优点另外 Transwell insert 还可以重复利用0.4μm的孔径大小 细胞穿不过的 细胞因子是能通过的
但是需要一定是平衡时间才能达到上下室一样浓度 5μm 8μm孔径大小的可以用于部分细胞的迁移实验，选择取决于细胞的体积大小您好
我最近在想做HUVEC和肿瘤细胞的共培养
我有几个问题想问一下 谢谢
1.我用 Transwell 的小室做的话 ，是不能用迁移实验的小室吗？那得需要孔径多大的小室呢？ 2.如果我观察血管形成的影响，用 Transwell 的小室做的话，到底需不需要铺胶 ，如果铺胶的话 比例一般是多少比较合适呢？比如以我们做侵袭，胶和1640的比例是1比7 配80微升。谢谢 如果知道的话
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wangyx520 若是六孔板 下室1ml培养基 即可哪种细胞种在上面 就要看你的实验设计 包括实验目的
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但是需要一定是平衡时间才能达到上下室一样浓度 5μm 8μm孔径大小的可以用于部分细胞的迁移实验，选择取决于细胞的体积大小您好 我最近在想做HUVEC和肿瘤细胞的共培养 我有几个问题想问一下 谢谢 1.我用 Transwell 的小室做的话 ，是不能用迁移实验的小室吗？那得需要孔径多大的小室呢？2.如果我观察血管形成的影响，用 Transwell 的小室做的话，到底需不需要铺胶 ，如果铺胶的话 比例一般是多少比较合适呢？比如以我们做侵袭，胶和1640的比例是1比7 配80微升。谢谢 如果知道的话
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yj1984ren edited on
如果要看A对B的作用 是看A分泌的因子对B有没有作用的话应该将A放在上面吧？
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看A分泌的因子对B的作用的时候，是将A细胞接种在下面
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yelan 目前实验已经结束，结果还可以。这2种细胞非接触共培养，培养液我选择了其中一种，原则是依据对培养液要求高的细胞而选择，同时保证此种培养液对另一种细胞生长基本无影响。共培养过程中由于要检测培养液中因子变化，培养液不宜过多，上下层接触即可，但是由于培养箱内温度影响，培养液会蒸发一部分，故应考虑这部分损失，因而预实验很重要，transwell小室不便宜（300元左右一个吧，记不清了）。细菌和细胞的共培养没做过，若是观察细菌对细胞的影响，还是将细胞放在下室，方面观察和实验后期处理，具体问题还请战友参阅相关文献。 恭喜楼主实验顺利结束，最近也准备做类似的实验，想请教两个问题：1. 楼主是否有对transwell小室内的细胞进行进一步的实验，如PCR、western等？2. transwell小室是否可重复使用？
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我想看A细胞对B细胞有没有诱导其分化，之前做的干预激活A细胞，然后用PBS冲洗细胞各孔2次。然后换新鲜培养基加血清再加入B细胞悬液在六孔板里直接共培养24h,检测收集上清做esisa,收集B细胞做流式。结果做出来都是阴性结果。去除实验操作和试剂灵敏度的问题，我分析最重要的原因，A细胞刺激后的上清是不是不应该去掉和冲洗，因为A细胞分泌的东西被去掉了，只单剩下A细胞与B细胞在六孔板里直接培养，A细胞的作用是不是减弱了很多，所以导致阴性结果。所以想我重新做A细胞放在六孔板内干预之前的时间点后，不去掉培养基，加入trabswell小室内种B细胞，下面ml培养基，上面1ml培养基，共培养。最后收集上室上清做elisa,收集上室的细胞做流式。请教各位，给写建议！
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姚书生 请问楼主
你最后两种细胞的培养液是怎么折中的呢？我是想把骨髓间充质干细胞和脐静脉内皮细胞间接共同培养请问楼主解决了吗？是如何选择培养液的呢？另外可以请教一下共培养诱导分化的效果明显吗？十分感谢！
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细胞共培养的transwell用多少孔的比较好呢？24孔可以吗
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用transwell做细胞迁移实验，求教
我的实验步骤大致是这样的：
1. Hela细胞与药物在培养瓶中共同孵育24小时
2. 移除原培养基，用无血清培养基洗涤几次；用胰酶消化并用无血清培养基收集细胞
3. 向transwell（8微米孔径）下室加600微升含10%FBS的培养基，上室加入200微升细胞悬液；孵育24小时
4. 移除上、下室的液体
5. 下室加入600微升4%多聚甲醛固定细胞半小时
6. 移除多聚甲醛，用棉签擦除未穿过膜的细胞
7. 下室加入600微升0.1%结晶紫染色10分钟
8. 用PBS洗涤小室
9. 在显微镜下观察细胞并计数。
由于我做的是细胞迁移实验而不是侵袭实验，所以没加基质胶。请大家帮我看看，我的实验步骤有没有错误或需要改进的地方？
另外我还有不懂的问题想请教。transwell小室中的那个膜是半透膜吗？如果不是的话，8微米孔径对FBS来说是很大的，上下室FBS浓度不同，下室FBS不久会很快扩散到上室而达到浓度平衡了吗？这样的话，上室细胞还怎么迁移到下室？
我是做transwell实验的新手，请大家多多指点。
你好，请问如何观察到底部有少量细胞落下来？
我是用24WELL plate 做的，放在显微镜下，调到板子底部视野，看到少量细胞就行了。
我也是24孔板，可是一般不是只能看到小室上室的细胞吗？所以显微镜调节是可以看到24底部的细胞的？喔本来还在想是不是要先把小室拿出来才能看呢，谢谢
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