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western膜蛋白的提取
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【求助】有人用过凯基膜蛋白提取试剂盒么~跑wb着急啊~
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问题已解决悬赏丁当:2
买了南京凯基的膜蛋白和浆蛋白提取试剂盒，浆蛋白有条带，可是膜蛋白跑了很久没跑出过条带。。。之前是担心所需组织量不够（要求是200-300mg，我的组织只有20mg左右）才跑不出来，后来换用大鼠心脏测试，组织量绝对够。。。而且在跑western之前进行了说明书上的蛋白浓缩步骤，可是在加loading buffer之后，蛋白沉淀怎么都溶解不掉~说明书也注明了如果有沉淀可以取上清继续上样，可是每次上样感觉样品往上浮，只有部分样品往孔里沉，而且跑出来什么都没有，连内参都没有。用的是β-actin的内参。。western之前浓缩步骤如下:1、取所得提取物，每100ul膜蛋白加入约300ul的溶解buffer和约100ul三氯乙酸（TCA）试剂，混匀后置冰上20-30min后，13000rpm，离心15min，尽可能去除上清。2、沉淀加入1ml丙酮，室温静置10min后，13000rpm离心15min。3、弃上清，沉淀真空旋干或置冰上干燥10min（敞开离心管盖），按适当体积比加入loading buffer（使用前没100ulloading buffer加入2-5ul β-巯基乙醇）溶解，彻底分散（枪头反复吹吸或剧烈涡旋），煮沸5min。【注：加入loading buffer后如有部分难容物，可取上清继续上样。】
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试剂盒没用过，猜测溶解buffer里应该含某种去垢剂抽提膜蛋白，这一步要充分混溶，再用TCA沉淀。我怀疑你直接加在了一起，膜蛋白没有被充分抽提，随着疏水相被弃了（上清）。
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另外，TCA一步加0.02%脱氧胆酸钠，丙酮沉淀这步省略掉吧，我怀疑这对膜蛋白复性不好。不过我没实验，你可以试试加和不加丙酮对你膜蛋白抽提的影响。
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Jimmy0909 另外，TCA一步加0.02%脱氧胆酸钠，丙酮沉淀这步省略掉吧，我怀疑这对膜蛋白复性不好。不过我没实验，你可以试试加和不加丙酮对你膜蛋白抽提的影响。谢谢，我试下看看~~~
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你好，我想麻烦问一下，你的问题解决了吗？另外，南京凯基的膜蛋白和浆蛋白提取试剂盒好用吗？我目前的实验也要检测哺乳动物细胞膜上的受体蛋白的表达情况，想咨询一下这个盒子的效果，麻烦了！也祝你实验顺利！
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新手一枚，买了凯基的膜蛋白试剂盒，想问一下关于loading buffer，盒子并没说是几×，那么应该按照什么比例来加到样品里呢，另外我做蛋白定量，浓度在3-4ug/ul的范围，按照说明书，之前的浓缩步骤不做直接加loading buffer煮蛋白可以么
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关于丁香园请教：有谁知道Lysis Buffer的配方？ - 实验交流 - 生物秀
标题: 请教：有谁知道Lysis Buffer的配方？
摘要: [请教：有谁知道Lysis Buffer的配方？] 请问有谁知道在哪儿可查针对不同蛋白的Lysis Buffer的配方？急！！！ 关键词:[]……
请问有谁知道在哪儿可查针对不同蛋白的Lysis Buffer的配方？急！！！
不好意思，弱弱的问，lysis buffer是上样缓冲液的意思么
Lysis buffer是裂解缓冲液，对很多蛋白都是通用的。楼主是需要过柱子纯化蛋白的裂解buffer吗？一般就是Tris盐酸缓冲液或磷酸钠盐缓冲液加上NaCl（非变性条件）而已，其实就是binding buffer。变性条件下的再加上高浓度的盐酸胍或尿素。一般公司卖的填料的纯化手册上都能很方便的查到，可去公司的网页上搜。
给你一个配方,我们裂解组织细胞用的,不知道有用没有.3M NaCl 50ul1M Tris-HCl(pH 7.4) 10ul0.5M EDTA 10ul100mM PMSF 10ul10% Triton X-100 100ulddH2O 820ul总体积是1ml.
我用过这种配方,提取细胞蛋白质的,挺好用.50mMTris-HCl(pH 6.8)100mM DTT2%SDS(电泳级)10%甘油DTT临用前加,DTT可用0.01M乙酸钠(PH5.2)配成1M贮存液
谢谢各位！！！
有没有组织Lysis Buffer的配方？
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【求助】膜蛋白提取
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请教大家曾使用过的比较成熟的细胞膜蛋白提取方法及其中的液体配方，谢谢！查看完整版本请点击这里：
ququer787 ( 13:03:24)
前些天用凯基的膜蛋白提取试剂盒提了 小鼠的 大鼠的 和心肌细胞系的膜蛋白 可是WB结果很不好 目的蛋白没有 只有在细胞系的全细胞蛋白中有条分子量不对的带，请教一下除了上述RIPA强配方之外，您其他的操作是怎样的，是不是和普通的提全细胞蛋白一样，最后需要离心吗？
49888 ( 13:03:55)
用RIPA强配方，把脱氧胆酸钠浓度调整至1.0%，同时加入NP-40和Triton X-100，浓度均为1%。我刚做了一个7次跨膜蛋白，LHR的WB。
========================================================
请问这位高手，可以把你的实验步骤、条件列出给大家看看吗？谢谢！
vvmmoy ( 13:04:24)
1. Wash adherent cells twice in the dish or flask with ice-cold PBS and drain off PBS.
2. Add ice-cold modified RIPA buffer to cells (1 ml per 107 cells/100 0.5 ml per 5 x 106 cells/60 mm dish).
3.&&Scrape adherent cells off the dish or flask with either a rubber policeman or a plastic cell scraper that has been cooled in ice-cold distilled water. Transfer the cell suspension into pre-chilled Eppendorf microcentrifuge tubes. put it on ice for 20 minutes to lyse cells.
4. After vortex-mixing, centrifuging at 12,000 rpm for 10 min. at 4 ° C. Remove the supernatant and quantitate using a BCA Protein assay .
49888 ( 13:04:55)
QUOTE:原帖由 vvmmoy 于
13:04 发表
1. Wash adherent cells twice in the dish or flask with ice-cold PBS and drain off PBS.
2. Add ice-cold modified RIPA buffer to cells (1 ml per 107 cells/100 0.5 ml per 5 x 106 cells/60 mm dis ... 要提取组织膜蛋白呢？应该怎样？组织与裂解液的比列如何？
birdfish ( 13:05:28)
以下是裂解液配方和方法
裂解液配方: 通常组织裂解液有三种,
1. 全细胞蛋白的分离提取液(mmol/L )：Tris-HCl 50, pH 7.5, NaCl 150, EDTA 5, EGTA 5, SDS 2%。
2. 胞浆蛋白提取液(mmol/L): Tris-Cl 50，pH 7.5, EGTA 2, EDTA 2, (DTT 2, Na Pyrophosphate 5, KF 50, Okadaic acid 50?M，5mg/L each of leupeptin, aprotintin, pepstatin A, chymostatin)。(括号内为磷酸酶抑制剂,如果不做磷酸化可不加如)
3. 膜相关蛋白提取液(mmol/L):胞浆蛋白提取液+ 0.5% NP-40。
-------------------------------
胞溶和膜相关蛋白的分离提取:
*冻存或新鲜的组织或细胞，按每mg组织10μl的比例加入胞浆蛋白提取液。
*手持式匀浆器匀浆、超声破碎。
*4℃ 30000g离心30min，取上清液作为胞溶蛋白成分(Cytosolic)保存。
*沉淀物再加入相同体积的膜相关蛋白提取液(胞浆蛋白提取液＋0.5％NP-40)。
*超声破碎，在4℃ 30000g继续离心30min，取上清液作为膜(包括细胞膜和各种细胞器膜)相关蛋白成分(Particulate)。
*BCA法蛋白定量 。
2541 ( 13:05:57)
我们通常说的总蛋白提取，是否包括胞膜，胞浆，和核蛋白？
bluelake ( 13:06:42)
是的，一般总蛋白提取液的强度都比较高，可以得到全蛋白
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【求助】做膜蛋白使用全蛋白提取试剂盒（RIPA）可不可以？
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这个帖子发布于9年零8天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做WB的目的蛋白是心肌细胞膜上的一种蛋白，提取时是否可以使用全蛋白提取试机？全蛋白提取试剂盒与膜蛋白提取试剂盒的差别是不是只在于前者提出来的蛋白中膜蛋白含量要少于后者？谢谢！
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我最近也准备提取膜蛋白，但还要提取其它蛋白，不知用什么办法提取好。
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提取摸蛋白我认为用RIPA是可以的.全蛋白抽提试剂盒本身按照裂解能力的大小也有区分.用它去提膜蛋白,首先效果不一定理想,其次杂蛋白特别多,对后续操作会产生不好的影响,所以建议使用专门的抽屉试剂盒,祝实验顺利
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mxm_sx edited on
刚看了RIPA的buffer组成。25 mM Tris/HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate and 0.1% SDS.NP40和SDS都是detergent，所以膜蛋白应该是可以释放和溶解在里面的。不知道您用的是什么办法破碎细胞。如果有一个positive control的方法做对照，我认为可以用此buffer提取做一个，然后用positive的方法做一个，同时比较提取液和提取后高速离心的膜碎片SDS-PAGE行为，即可以比较其提取效果。没做过动物细胞的蛋白提取，仅供参考:)
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碧云天公司的提取蛋白裂解液中有几个系列，里边有说明哪些产品对提取膜蛋白效果好，
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lysis buffer的选择依赖于你所研究蛋白质的位置和性质：1）细胞浆蛋白（可溶性）： Tris Buffer2）细胞浆蛋白（结合到细胞骨架）：Tris-Triton buffer3)
膜结合蛋白：Np-40或RIPA4）核蛋白：RIPA5）线粒体蛋白：特殊的抽提裂解液6）全细胞蛋白：Np-40 or RIPA
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