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中国组织工程研究与临床康复笫，3眷第53雳出版
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肾移植患者群体反应性抗体水平与移植肾急性排斥的关系术★
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: 767-772&&&&DOI: 10.3969/j.issn.14.05.019
移植与免疫 transplantation and Immunology
单中心两种方法检测280例群体反应性抗体的对比分析
匡国杰，武洪文，周文强，肖&漓
解放军309医院器官移植研究室，北京市&100091
Single-center comparative analysis of panel reactive antibodies of 280 cases detected by two methods
Kuang Guo-jie, Wu Hong-wen, Zhou Wen-qiang, Xiao Li
Department of Organ Transplantation, the 309th Hospital of Chinese PLA, Beijing 100091, China
参考文献(0)
群体反应性抗体(panel reactive antibody，PRA)是指群体反应性抗人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的抗体。接受器官移植、输血、妊娠是产生群体反应性抗体的重要因素[1-2]。按照不同分类标准，抗HLA抗体可有多种类型：Ⅰ类抗体、Ⅱ类抗体，IgG，IgM，供体特异性、供体非特异性等[3]。本研究主要检测HLA-Ⅰ类抗体，HLA-Ⅱ类抗体。最近的一些研究认为Ⅰ类、Ⅱ类抗HLA抗体出现都与急性排斥反应、慢性排斥反应有关[4-8]。目前，群体反应性抗体在器官移植中，特别是在肾脏移植中得到广泛的重视。
群体反应性抗体是决定肾移植患者手术是否可行及预测肾移植后急性排斥反应的良好指标。移植前致敏，即移植前群体反应抗体或淋巴毒交叉试验阳性的患者，移植后排斥反应的发生率会明显增加，导致移植物存活率下降[3-4，9-11]。国内外研究表明，肾移植前对受者抗HLA抗体进行监测，对预测移植风险、避免排斥反应的发生等具有重要意义[12]。当受者体内预存HLA抗体，特别是有供者特异性HLA抗体时，若移植前能够及时检测出此类抗体，在选择供者上可避开具有相应抗原的供者，则可避免潜在的免疫反应的发生[13-14]。而在肾移植后出现HLA抗体，则大多会发生排斥反应，如治疗延缓则可导致移植失败[1]。所以能够及时准确的检测出肾移植受者手术前后群体反应性抗体的水平及特异性，对指导临床选择合适供者、监测免疫状态具有重要意义。
目前临床上多应用酶联免疫吸附方法(ELISA法)检测群体反应性抗体，随着科学技术水平的提高，液态芯片技术(Luminex)成为一种新型的检测技术逐渐应用于临床。液态芯片，是美国Luminex公司在流式细胞技术、ELISA技术和芯片技术和芯片技术基础上推出的多重分析技术平台，其最大特点是一次反应最多可同时检测500种指标，是惟一得到美国FAD批准的，也是惟一被纳入美国临床实验室质控网络的高通量诊断技术[15]，被国际世界专家评价为临床诊断趋势性技术之一。随着抗HLA抗体检测方法灵敏度的进一步提高，移植受者体内抗HLA抗体的检出率上升到95%，几乎所有的移植排斥反应均可检测到抗HLA抗体[16-17]。本试验的目的在于初步比较Luminex法与ELISA法检测血清标本中群体反应性抗体的效果。
杂志出版内容重点：；；；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；；
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设计：观察性实验。
时间及地点：于月在解放军第309医院器官移植研究室完成。
&血清标本：选取月在解放军第309医院等待肾移植患者和肾移植后患者血清标本共280例。
ELISA：瑞士TECAN公司酶标测试仪M200、北京东方荣盛生物科技有限公司提供的 Wellwash 4 MK2 全自动洗板机。
Luminex：美国Luminex100、江苏麒麟医用微量震荡器。
ELISA：美国GTI公司提供的HLA筛查试剂盒(QUIKSCREEN针对HLA-Ⅰ类抗体、 B-SCREEN针对HLA-Ⅱ类抗体)；HLA抗体确定试剂盒(QUIK-ID CLASSⅠ、C2ID CLASSⅡ)。
Luminex：美国Luminex提供的LIFECODES LMX试剂盒；LIFECODES ID CLASSⅠ、LIFECODES ID CLASSⅡ试剂盒。
ELISA法操作步骤：选取ddH2O稀释10&洗脱液，每孔区250 &L润板10 min；弃去洗脱液，在微孔内加入&& 50 &L稀释液稀释后的患者血清，封膜后在电热恒温箱孵育30 min。应用Wellwash 4 MK2 全自动洗板机洗板4次，甩干，再加入由碱性磷酸盐标记的抗人免疫球蛋白试剂(Anti-IgG)50 &L，电热恒温箱孵育30 min。重复洗板4次，甩干，加入用ddH2O溶解好的PNPPhe底物按1∶100的浓度稀释，每孔取100 &L显色15-20 min，在加入氢氧化钠终止液使反应停止。最后，使用瑞士TECAN公司酶标测试仪M200于405 nm波长处读取数据。采用GTI公司提供的电脑软件分析ELISA阳性血清中的HLA抗体特异性及百分比值。
Luminex法操作步骤：在Millipore反应孔中加入ddH2O润湿滤膜2-5 min。真空泵抽掉ddH2O(控制真空压力，压力过强会使珠子与膜粘连无法悬浮，从而导致 Luminex读珠子数失败，抽真空时，使用的压力大小以能够使孔内液体下降较缓慢为宜)，每个反应孔中加入20 &L Wash Buffer，相应孔中加入7 &L样本血清以及3 &L阴阳性对照血清。每孔加入2.5 &L Beads(用前充分混匀微珠，以保证每个反应孔都加入足量的微珠，否则会影响上机读板时间以及结果的判读)，平板振荡器室温避光孵育30 min；应用真空泵洗涤除去没有结合的抗体或其他杂质，再加入PE标记的二抗，置于平板振荡器室温避光孵育30 min，应用Wash buffer洗涤Millipore微孔板(洗涤不充分，会降低二抗与微珠上结合IgG的能力，导致假阴性结果)，再用真空泵抽掉液体，此步骤重复3次。最后通过Luminex平台获取特异性结合微珠的荧光信号，再利用软件分析得到特异性抗原类型。
主要观察指标：①两种方法检测出群体反应性抗体阳性的范围(即阳性百分比)。②Luminex检测出抗体的平均荧光强度值。
统计学分析：应用SPSS 13.0软件，对比ELISA法和Luminex法检测HLA-Ⅰ类、Ⅱ类结果，运用配对四格表资料的&2检验，P & 0.01为差异有显著性意义。
杂志出版内容重点：；；；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；；
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群体反应性抗体一直是器官移植学科的研究重点。有研究表明即使预存少量的供者特异性抗体也能导致移植后短期内发生急性体液性排斥反应，影响移植肾的存活率[18-19]。还有研究报道，发生严重排斥反应的受者群体反应性抗体(PRA)升高，移植前群体反应性抗体& 50%的肾移植受者，移植肾存活率只有59%，1年存活率比群体反应性抗体&50%者低26%。所以移植前检测抗群体反应抗体有助于减少排斥反应的发生，移植后有助于及时判断排斥反应的类型，有利于做出相应的治疗方案。目前在器官移植临床和科研实践中，液相芯片技术(Luminex)广泛用于检测受者血清中抗同种异体移植物的相关抗体，其灵敏度远高于常规的补体介导的细胞毒试验和ELISA等方法[20]。
酶联免疫吸附试验(ELISA)检测群体反应抗体，是将已知的抗原吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。本方法操作步骤复杂，灵敏度不高，低浓度的抗体不易检出，并且容易因受到试剂、标本、人工操作和环境等各方面因素的影响，而出现假阳性或假阴性结果。后来的研究发现，EIISA法不能灵敏准确的检测出所有抗HLA抗体[21]。
Luminex方法是集流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术[22-26]。该方法是在微米级聚合物微球中装入不同发光波长和强度水平组合的荧光材料，根据两种染料比例的不同可以将微球分成100种，每一种拥有一个编号[27-28]，每种微球因为内部荧光比例的不同，具有特定的光谱特征，可被激光特异的识别[29]；分析过程中，不同编号的微球包被不同的探针分子，检测样品中的目的分子，目的分子再与带有荧光的报告分子结合(图1)。检测时，同流式细胞仪相似，Luninex100检测系统将反应微球单个排列送入检测通道，每一个微球单独检测。该仪器同时发射红色和绿色两种激光，同时检测微球上的红色分类荧光和报告分子上绿色荧光强度，红色激光用于鉴别微球，即可知探针种类，绿色激光用于分析报告分子，并将结果通过光电倍增体系转换成数值输出，系统对微球得到的信号值进行统计，确定检测物的种类和数量。由于每种微球具有特定的荧光光谱，可被特异的识别出来，所以可以将不同编码的微球标记不同的探针分子，混合在一个反应体系中。检测一个样本，最大限度可以同时使用100种微球标记100种探针分子，检测一个样本中100种目的分子。&
液相芯片与固相芯片最大区别在于，液相芯片完全在液相中进行生物反应，反应环境更接近于自然状态，有利于保持生物分子的空间构象和生物活性，反应动力学好，反应充分，速度快，无需洗涤；固相芯片只有一种分子处于游离状态可以自由移动，需要一个固相溶解沉积过程，反应速度慢，不充分。Luminex液相芯片主要有以下优点[30-33]：①高通量：可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析。根据荧光素的比例不同可以将微球分成100种，每种荧光微珠包被着不同的纯化的HLA抗原，从而可识别100种不同的抗体，获得比较精确的检测结果，采用真空抽滤洗涤的方法有效避免了多次洗板等人工操作带来的误差。而传统免疫分析法一次只能检测一个项目。②样本用量少：由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同的生物学反应，所以显著节省了样本用量，此种试验方法仅需要少量的血清(7 &L)就可以同时检测群体反应Ⅰ类和Ⅱ类的抗体，故此方法应用于群体反应抗体检测是抗体检测技术的一大进步。③操作简单、快速[34]：由于是基于液相反应动力学，因此反应速度快，孵育时间比传统的固相检测短。④灵敏度高：微球表面积大，每个微球上可包被100 000个捕获抗体，如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合，提高检测灵敏度[35-36]。⑤准确性高：微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子成正比。由于液相芯片技术的检测范围大，因此不需要像ELISA检测中那样需将样本多倍稀释，从而减小了误差。⑥重复性好：这是由于：第一，与ELISA依靠酶放大作用的比色读数相比，液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏；第二，每种微球检测100个，最终取荧光强度的中值作为结果，这相当于对每个样本重复检测了100次，而ELISA仅为双复孔或三复孔，因此液相芯片检测结果的准确性和重复性是ELISA无法比拟的。⑦费用低：同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动，降低检测成本。由于液相芯片具有上述优势，其在药物筛选、临床诊断以及基础研究中得到广泛的应用。目前，液相芯片检测领域包括细胞因子、病原微生物、基因突变以及HLA、基因表达分析、细胞信号转导途径研究等方面[37-39]。
人类白细胞抗原(HLA)是一组免疫系统中通过多态性表现功能性的糖蛋白，在人类免疫系统中起着重要的作用。然而，作为一个高度多态性的系统，HLA分子可以成为在器官移植后排斥反应的过程中产生的抗体反应的目标。这些特异性抗体对移植物的存活起着重要的影响。实验将待测血清与包被了特异性抗原的微珠加入到Millipore微孔板中，经过孵育，若血清中存在HLA抗体则可与微珠上的抗原结合，利用抽真空方法洗涤去没有结合的抗体或其他杂质，再加入PE标记的二抗染色，孵育后，通过Luminex平台获取特异性结合微珠的荧光信号，再利用软件分析得到特异性抗原类型。检测结果以免疫荧光强度均值(BCM)表示，其值&1 000为阳性，1 000-4 000为弱阳性，4 000-10 000为中阳性，&10 000为强阳性。将检测出现单抗原微珠抗体的位点与供者的HLA位点进行比较，从而判断是否进行移植手术。
文献报道，Luminex技术灵敏度和特异性都远远高于以ELISA为代表的传统检测受者抗HLA抗体水平的技术[40-42]。这两种方法都是将纯化的HLA抗原固定在固体介质上。ELISA-PRA方法将抗原固定在聚苯乙烯微量滴定板上，Luminex-PRA方法将抗原固定在微球上，待测血清与之混合孵化，再加带标记的二抗(山羊-抗-人IgG)放大反应的信号，区别在于ELISA方法采用酶标二抗，酶标仪检测酶催化底物反应的颜色，而Luminex-PRA方法是采用更准确的液相芯片技术直接检测结合上二抗的微球荧光。从方法学上分析，两者原理类似，结果具有相关性，但Luminex-PRA方法在技术上决定了最后的信号的检测更灵敏和准确。
目前最常用ELISA方法检测抗HLA抗体，其结果不受IgM的干扰和其他因素的影响，定型和定量同时完成，受到I临床的高度重视。但有资料表明，ELISA阴性的患者在接受移植后，依然会发生超急性排斥反应或急性排斥反应，不能灵敏准确的检测出所有的抗HLA抗体[43]。国内王庆华等[44]以接受亲属活体肾移植的34例受者为研究对象，术前采集受者血清，同时应用Luminex技术与ELISA方法进行抗HLA-Ⅰ类、Ⅱ类抗体检测，并且记录术后早期急性排斥反应发生情况。结果用Luminex技术检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性率为41.2%(14/34)，检测抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率为38.2%(13/34)；用ELISA方法检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性率为2.9%(1/34)，检测抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率为8.8%(3/34)；两种方法检测抗HLA-Ⅰ类、Ⅱ类抗体阳性率的差异有显著性意义(P & 0.05)。用Luminex技术检测18例术前抗体阳性者中有8例术后早期发生急性排斥反应(占44.4%)；16例术前抗体阴性者中，有2例术后早期发生急性排斥反应(占12.5%)。用ELISA方法检测例术前抗体阳性者中，有3例术后早期发生急性排斥反应(占75.0%)；30例术前抗体阴性者中，有7例术后早期发生急性排斥反应(占23.3%)。结果显示Luminex技术检测肾移植受者抗HLA抗体的检出阳性率高于ELISA方法，对于移植后早期急性排斥反应的监测可以提供有用的信息。本文通过对比两种方法所测结果可以发现，Luminex-PRA方法的阳性检出率33.6%(Ⅰ类25.0%，Ⅱ类20.7%)明显高于ELISA-PRA方法的阳性检出率18.9%(Ⅰ类12.8%，Ⅱ类12.5%)，配对卡方检验(McNemarTest)P & 0.01，二者检测PRA结果差异显著。HLA-Ⅰ类抗体的结果，ELISA-PRA阴性/Luminex-PRA阳性血清34例，PRA结果百分比值集中在10%-34%之间。HLA-Ⅱ类抗体的结果，ELISA-PRA阴性/Luminex-PRA阳性血清23例，PRA结果百分比值集中在6%-20%之间。由此得出酶联免疫吸附方法对低浓度的抗HLA抗体不敏感。两种方法检出差异主要集中在低浓度区。在此低浓度区很可能存在抗供者特异性抗体，移植前预存有抗供者特异性抗体，将影响术后移植肾功能和长期存活[45-47]。Luminex准确分析出供者特异性抗体，帮助排除不合适的供者，尤其是对于活体肾移植中有捐肾意愿的亲属，可以避免不必要的损失，减少供体肾资源的浪费，保证良好的社会效益[48]。两种方法在检测群体反应抗体结果有统计学意义，证实了Luminex技术使群体反应抗体分析的敏感性得到进一步提高，移植前检测出低浓度的群体反应抗体，能更准确的预测移植物功能的丧失和免疫学排斥反应事件的发生，保障真正的群体反应抗体阴性获得安全性系数更高的移植[49]。
Luminex检测技术与ELISA法相比，具有特异性好、高通量、高敏感、重复性好、成本低、检测样本用量少、客观可靠等优点[50]，能为临床提供更精准，更具体的信息。为临床提供了一种可靠的预测体液性排斥的指标，对于减少移植后排斥反应，提高移植成功率具有一定的临床意义。
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群体反应性抗体是预测受者致敏状态的一个敏感指标，对临床筛选合适供者，减少排斥反应，提高移植物存活率及早期诊断排斥具有重要意义。目前，移植前检测抗HLA抗体已是移植中心的常规项目，准确监测抗HLA抗体会给防治排斥反应及指导免疫抑制治疗带来很大帮助。然而使用不同敏感度的检测方法检测肾移植后HLA抗体的结果差异很大。近年来，液态芯片逐渐兴起，是美国Luminex公司在流式细胞技术、ELISA技术和芯片技术和芯片技术基础上推出的多重分析技术平台，唯一得到美国FAD批准的高通量的诊断技术，其重复性，灵敏度均优于传统的酶联免疫吸附法。被世界专家评价为临床诊断技术趋势之一。应用此技术，能为临床提供更准确的信息。
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研究亮点: 1 准确检测群体反应性抗体是决定肾移植是否可行及预测肾移植后急性排斥反应的良好指标。
2 Luminex技术检出肾移植受者HLA抗体的阳性率高于ELISA方法，可以为移植后早期急性排斥反应的监测提供有用的信息。
3 Luminex技术能检测出低浓度的HLA抗体，并且能检测出抗HLA-DQ位点，能更好地降低移植排斥反应的发生。
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方法：选取280例肾脏病患者血清标本，同时应用ELISA和Luminex两种方法检测群体反应性抗体阳性率，并运用配对四格表资料的&2检验进行统计学分析。
结果与结论：ELISA法检测群体反应性抗体阳性率为18.9%，Luminex法检测群体反应性抗体阳性率为33.6%。ELISA法检出抗HLA-Ⅰ类抗体和抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率分别为12.8%和12.5%；Luminex法检出抗HLA-Ⅰ类抗体和抗HLA-Ⅱ类抗体阳性率分别为25.0%和20.7%。Luminex法的阳性检出率明显高于ELlSA法且Luminex法能准确检测到低浓度抗体。配对四格表资料的&2检验P & 0.01，显示两种方法检测肾脏病患者群体反应性抗体结果差异有显著性意义。结果显示与ELISA法相比，Luminex技术具有更高的灵敏度和准确性，更适合应用于临床检测。
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Abstract：BACKGROUND: Liquid chip techniques (Luminex) is a recently rising method for detecting anti-panel reactive antibody, which is characterized by high sensitivity, and strong specificity, less interference and high flux.
OBJECTIVE: To compare the sensitivity and detection difference of panel reactive antibody in serum of kidney disease patients detected by enzyme-linked immunosorbent assay and Luminex.&
METHODS: Serum samples of 280 patients with kidney disease were selected. The enzyme-linked immunosorbent assay and Luminex methods were used to measure positive rate of panel reactive antibody. Chi-square test for fourfold table data was utilized for statistical analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive rates of panel reactive antibody were respectively 18.9% and 33.6% as detected by enzyme-linked immunosorbent assay and Luminex method. The positive rates of anti-HLA-I antibody and anti-HLA-II antibody were respectively 12.8% and 12.5%, as detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The positive rates of anti-HLA-I antibody and anti-HLA-II antibody were respectively 25.0% and 20.7%, as detected by Luminex method. Positive detection rate was significantly higher in the Luminex group than that in the enzyme-linked immunosorbent assay group. Moreover, Luminex method could precisely detect the low-concentration antibody. Chi-square test for fourfold table data showed P & 0.01. Significant differences in the differences of panel reactive antibody of kidney disease patients were detected between the two methods. Results demonstrated that compared with enzyme-linked immunosorbent assay, Luminex method is more sensitive and accurate, and more suitable for clinical detection.
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Key words：
中图分类号:&
周文强，硕士，主管技师，解放军309医院器官移植研究室，北京市
作者简介: 匡国杰，女，1985年生，河北省唐山市人，汉族，2010年张家口医学院毕业，初级检验技师，主要从事器官移植HLA配型及群体反应性抗体与肾移植术后排斥反应发生的关系等方面的研究。
引用本文: &&
匡国杰,武洪文,周文强等. 单中心两种方法检测280例群体反应性抗体的对比分析[J]. 中国组织工程研究, ): 767-772.
Kuang Guo-jie,Wu Hong-wen,Zhou Wen-qiang et al. Single-center comparative analysis of panel reactive antibodies of 280 cases detected by two methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, ): 767-772.
2.1&两种方法检测群体反应性抗体的阳性率比较&选取的280例血清样本中，Luminex-PRA阳性(Ⅰ类阳性且/或Ⅱ类阳性)血清样本94例，占总数的33.6%；ELISA-PRA阳性(Ⅰ类阳性且/或Ⅱ类阳性)血清样本53例，占总数的18.9%；Luminex-PRA法的阳性检出率明显高于ELlSA-PRA法(&2 =15.51，P & 0.01，表1)。
2.2 &两种方法检测HLA-Ⅰ类抗体的阳性率比较&Luminex检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性为70例，占总数的25.0%，ELISA检测抗HLA-Ⅰ类抗体阳性为36例，占总数的12.8%，两种方法检测抗HLA-Ⅰ类抗体结果的符合率为87.8%(246/280)。配对卡方检验(McNemar Test)，显示两种方法所测结果差异有显著性意义(&2=13.45，P & 0.01，表1)。这与王庆华等[17]研究结果一致。
2.3&两种方法检测HLA-Ⅱ类抗体的阳性率比较&Luminex方法检测抗HLA-Ⅱ类阳性为58例，占总数的20.7%，ELISA检测抗HLA-Ⅱ类阳性为35例，占总数的12.5%，两种方法检测抗HLA-Ⅱ类抗体的结果符合率为91.78%(257/280)。配对&2检验(McNemar Test)，显示两种方法所测结果差异有显著性意义(&2 =6.82，P & 0.01，表1)。
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初筛检测HLA-Ⅰ类抗体，ELISA-PRA阴性/ Luminex-PRA阳性血清34例，分别应用PRA/Luminex方法做确定，Luminex检测结果百分比值最高值34%，最低值10%，其中1例免疫荧光强度(BCM)值为9 563，其余均& 4 000(即弱阳性)，而ELISA确定检测为阴性。
&检测HLA-Ⅱ类抗体，ELISA-PRA阴性/Luminex-PRA阳性血清23例，Luminex检测结果百分比值最高为20%、最低为6%，平均荧光强度(BCM)值均& 3 652(即弱阳性)，ELISA确定结果为阴性。由此得出酶联免疫吸附方法对低浓度的HLA抗体不敏感。
作者还发现了1例应用Luminex技术进行单抗原微珠抗体检测到了DQ位点，这是酶联免疫吸附试验无法检测到的。
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没有本文参考文献
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肾移植患者群体反应性抗体水平与移植肾急性排斥的关系贾保祥，武俊杰，田野0　引　　　言　　肾移植患者体内群体反应抗体产生通常由受者术前输血、移植和妇女妊娠所致。目前众多实例和资料证实，群体反应抗体的存在与否及该抗体的致敏程度对于是否发生排斥和移植物的存活率高低及移植后器官功能的实现都有着重要意义，特别是与移植肾的急性排斥和肾功能延迟恢复有着不可忽视的作用。　　通过淋巴细胞冷冻板检测群体反应性抗体与当前多采用的酶联免疫法相比各有所长，酶标法具有特异性高、敏感性高等，而淋巴细胞冷冻板则准确性强、容易分辨特异性等。酶标法试验操作要求严格、抗体特异性误差多，而淋巴细胞冷冻板则操作简单，抗体特异性容易分析，所以细胞板法检测群体反应抗体能更真实反映移植受者体内的抗体情况。因此本实验将00-01所做的淋巴细胞冷冻板检测的群体反应性抗体结果与临床肾移植受者排斥情况进行分析。群体反应性抗体是指器官移植受者体内存在的抗人类白细胞抗原(HLA)抗体，妇女妊娠、输血、接收器官移植、长期透析是产生群体反应性抗体抗体的重要因素，是器官移植后引起排异的主要因素之一，对移植器官的存活率也有显著影响。随着免疫抑制剂的研究和应用，肾移植的近期和远期存活率得到了进一步的提高，但移植肾的排斥反应仍是影响存活率的重要因素之一。　　研究证明，肾移植患者体内群体反应性抗体的存在及该抗体的致敏程度与移植后发生急性排斥关系甚为密切，手术前后群体反应性抗体抗体的存在是影响肾移植物存活率及肾功能的重要因素之一。　　本文回顾性分析了633例肾移植患者术前术后群体反应抗体水平与移植肾急性排斥的关系，报道如下。1　对象和方法　　设计：回顾性病例分析。　　时间及地点：于00-05在北京首都医科大学附属北京友谊医院泌尿科肾移植研究室完成。　　对象：回顾性分析了633例肾移植患者术前和术后一两个月内群体反应抗体与急性排斥反应的关系，其中男348例，女285例，年龄范围16～67岁。所有患者在接受本实验相关检测及治疗前均已知情同意。　　方法：　群体反应抗体检测：采用美国One Lambda公司和德国BioteSt公司淋巴细胞冷冻板(注；此期间国内还未有美国One Iambda公司提供的EUSA筛选HLA-Ⅰ类、Ⅱ类混合抗原板和鉴定板)包含有人类白细胞抗原HLA-A抗原20种，HLA-B抗原41种，HLA-Cw抗原11种。　实验步骤如下：从-70℃冰箱中取出细胞板，放入37℃温箱中孵育5min，低速离心5min，甩掉细胞保存液，加入石蜡油，然后加入患者血清1μL，孵育30min，再加入兔补体5μL，1h后加入50g／L伊红5μL，5min后再加入体积分数12％甲醛5μL，1h后再倒置显微镜下观察结果。　结果判断：群体反应抗体0～10％为无致敏：群体反应抗体11％～50％为轻度致敏；群体反应抗体＞50％为高度致敏。　　主要观察指标：术前及术后肾移植患者群体反应抗体水平、临床排斥反应情况。　　设计、实施、评估者：实验设计、实施及评估均由本文第一作者完成。　　统计学分析：使用SPSS 13.0分析数据，采用相关分析，分析术前群体反应性抗体阴性和阳性与术后排异与否的相关关系，二者在P=0.01水平有明显相关性，统计学处理由文章第一作者完成。2　结　　　果2.1　肾移植前后抗体分布情况　对633例肾移植术前患者做了群体反应性抗体检测，术前群体反应性抗体阴性591例，群体反应性抗体阳性42例，阳性率占6.6％(42／633)。术前群体反应性抗体阴性的591例患者中，术后群体反应性抗体阳的患者164例，阳性率占27.8％(164，591)其中移植术后1周群体反应性抗体阳性86例，术后2周群体性反应抗体阳性78例。2.2　肾移植术前及术后群体反应性抗体与排斥反应的关系　移植前群体反应性抗体阴性591例，其中61例术后发生急性排斥，占10.3％(61／591)；移植前群体反应性抗体阳性42例，术后有30例发生了急性排斥，占71.4％(30／42)；有12例未发生急性排斥，其中4例移植前抗体的强度较弱(群体反应性抗体11％～50％)，另2例抗体的强度较强(群体反应性抗体＞50％)，因为有些抗体实际上并不造成对移植物的损害，如无针对抗供体的特异性抗体、IgM和自身抗体等。其余6例肾功能延迟恢复。在肾移植术前群体性反应抗体阴性和阳性术后发生排斥的比较差异有非常显著性意义(P＜0.001)。2.3　肾移植前群体反应性抗体阴性的患者术后发生急性排斥反应情况　肾移植术前、术后群体反应性抗体均为阴性的患者427例，其中24例术后发生了急性排斥，占5.6％(24／427)。此类患者发生的急性排斥可能与群体反应抗体无关。肾移植术前群体反应性抗体阴性，肾移植术后阳性的164例，其中有70例发生了急性排斥，占42.7％(70／164)。在肾移植前群体反应性抗体阴性与术后群体反应性抗体阳性并发生排斥的比较差异有非常显著性意义(P＜0.001)。2.4　术前群体反应性抗体阴性和阳性与术后排异与否的相关性　术前群体反应性抗体阴性和阳性与术后排异与否的相关系数为0.612，术后群体反应性抗体阴性和阳性与术后排异与否的相关系数为0.685，二者在P=0.01水平有明显相关性。3　讨　　　论　　Meng等对73例术前群体反应性抗体阳性肾移植患者和81例群体反应性抗体阴性的术后2年肾存活率及肾功能情况做了比较，发现术前群体反应性抗体阳性患者的肾存活率及肾功能明显低于群体反应性抗体阴性患者，且术前群体反应性抗体Ⅰ类、Ⅱ类同时阳性的患者的肾存活率更糟。Nicknam等的研究也显示，术前群体反应性抗体I类阳性患者的血肌酐高于正常水平。目前供者特异性抗体(DSA)在影响。肾移植存活率中的作用也被备受关注，是研究的热点，先已有研究证明AMS(Ant.body Monitoring System)实验是一种有效的理想的监测供者HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗体的方法。有报道称术前检测DSA，有助于对患者采取更有针对性的临床及免疫治疗，选择合适的免疫抑制治疗，以达到更好的移植效果。国内更有报道提出针对供肾者特异性HLA抗体可能是引起移植肾免疫反应的原因之一，HLA-Ⅰ类抗体与免疫反应关系较为密切。Mao等对35例肾移植急性排斥患者进行了研究，发现27例患者产生了供者特异性抗体，其他8例为非供者特异性抗体，并且提出非供者特异性抗体也会引起移植后排异，可能是因为非供者特异性抗体与供者特异性抗体共享相同的抗原决定基。Campos等则在研究中报道，HLA-Ⅱ类抗体与术后肾功能衰退的主要原因，并提出术后长期监测HLA-Ⅱ类抗体以保证肾的长期存活。Langan等也提出术后HLA-Ⅱ类抗体与肾移植器官的存活有关，有HLA-Ⅱ类抗体及CD30的肾移植患者器官移植失败的危险性最高。Lee等经过8年的系统研究得到两项有意义发现。首先，通过长期抗体监测发现，抗体在体内存在许多年后移植物最终才被排斥。第二，所发现的抗体，经常不是针对供者特异性抗体。供者特异性抗体有可能在外周血中不被发现，这是因为它们被肾脏吸收了。然而，当肾被完全排斥的时候，供者特异性抗体在外周血中总是被发现。本文结果显示术前和术后群体反应性抗体阳性的患者发生急性排异的概率较阴性患者高。移植前受者群体反应抗体的水平和特异性对移植肾的急性排斥和肾功能的恢复有着不可忽视的作用。在移植后的任何时期，大约20％患者体内存在HLA抗体。　　从本实验中可见，肾移植术前的患者抗HLA抗体的致敏率为6.6％(4／633)，而肾移植术后则高达28％。由此可见，移植肾的抗原刺激导致了抗体的产生。在抗HLA抗体高敏感患者中，去除抗体高敏感患者的抗HLA抗体的方法很多，这些方法包括：静脉注射免疫球蛋白、药物治疗、血浆置换、蛋白质A免疫吸附等。Kawase等采用高强度的免疫抑制剂成功的完成了1例3次移植的高致敏患者。此例患者第1次手术为1999年其父给予的亲属供肾，由于慢性同种移植肾病，于2005年重新透析。二次移植时间为接受了第二次尸体肾移植，术后3d发生加速性急性排斥反应而丧失移植肾。后提出用其兄弟的肾再次移植。其第3次移植前群体反应性抗体Ⅰ类抗体为88％，Ⅱ类抗体为96％。3次移植前的3周给予霉酚酸酯并血浆置换3次。于实施手术。免疫抑制为他克莫司与霉酚酸酯、甲泼尼龙和巴利昔单抗。术后立刻发生移植物血流和尿量减少，怀疑发生超急排斥反应。通过血浆置换和一次剂量的美罗华[200mg，美罗华(CD20人鼠嵌合性单克隆抗体)]的治疗，即使群体反应性抗体3周后仍阳性，移植肾恢复功能。移植后6个月，血肌酐水平达到9mg／L。实际上各种去除抗体的方法均有其局限性，往往并不能根除抗体，而良好的供者-受者HLA配型和抗供者特异性抗体阴性则可保证移植手术的成功。Li等例研究了87例活体肾移植患者术前及术后6个月的群体反应性抗体和肾功能，并监测患者的排异情况及供者特异性抗体和其他非特异抗体。在术前及术后群体反应性抗体检测中，47例(54％)表现为群体反应性抗体阴性；15例(17％)表现为术前、术后阳性：12例(14％)表现为术前阳性、术后阴性；13例(15％)表现为术前阴性、术后阳性，在此13例患者中，有5例(38％)检测到供者特异性，8例(62％)检测到非供者特异性。供者特异性阳性的患者有80％出现了排异症状。术后出现抗体的患者，其5年肾存活率为69％，而术前术后抗体均为阴性的患者，5年肾存活率为96％，术前阳性术后阴性的患者，5年肾存活率88％，术前术后均阳性的，5年肾存活率为93％。因此肾移植患者若在术后产生了新的抗体，尤其是供者特异性抗体，尽管术前群体反应抗体阴性，其发生排异的概率较高。　　综上所述，群体反应性抗体的存在与否及该抗体的致敏程度对于是否发生排斥和移植物的存活率高低及移植后的器官功能的实现都有着重要意义，特别是与移植肾的急性排斥和肾功能延迟恢复有着不可忽视的作用，检测肾移植受者手术前后群体反应性抗体水平至关重要，因此，应在移植术前对患者体内的HLA抗体水平及性质有一个明确的了解，并据此选择器官和移植手术时机。如果患者体内HLA抗体水平很高，则提示此时不宜手术，否则很可能发生超急排斥或急性排斥。这时应通过恰当的治疗方法来改善机体的免疫状态，待机体抗体水平降到较低时再考虑进行移植手术。另外，对于体内抗体性质的确定也可以为受者选择合适的供体提供参考。比如患者体内存在HLA-A11抗体时，则应避免选择具有HLA-A11抗原的器官。即要避免应用具有相应抗原的供者器官。此外，对于群体反应抗体水平的监测，有助于预测移植肾的早期排斥反应，从而帮助医生调整治疗方案及指导免疫抑制剂的应用。【作者单位】首都医科大学附属北京友谊医院泌尿科，北京市 100050【来源】《中国组织工程研究与临床康复》第13卷第53期 出版
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