PHD2对结肠癌细胞糖酵解活性的调控作用及分子机制研究--《第三军医大学》2012年博士论文
PHD2对结肠癌细胞糖酵解活性的调控作用及分子机制研究
【摘要】：一、背景
正常细胞向恶性细胞的转化过程中伴随着代谢途径的重塑，其中最典型的是肿瘤细胞即便在氧气供应充足的情况下也主要以糖酵解而非氧化磷酸化提供能量，这种糖代谢途径的重塑被称为有氧糖酵解或Warburg效应。该表型可促使肿瘤细胞产生凋亡耐受、生物合成前体分子生成增加以及侵袭能力增强。肿瘤细胞能量代谢的适应性改变也是导致肿瘤对放化疗耐受的重要原因。目前，肿瘤糖代谢重塑的分子基础和确切机制尚未完全阐明。
实体肿瘤在不断生长的过程中，其中心会形成缺氧环境。肿瘤细胞为应对缺氧的压力，遂启动异常活跃的糖酵解，同时启动促血管机制以增加肿瘤血管形成，从而使自身得以存活和生长。在这一过程中，感受瘤体内氧分压的改变并及时启动肿瘤糖酵解是其中的关键环节。我们推测，作为细胞内最重要的氧感受器，脯氨酸羟化酶(prolylhydroxylases, PHDs)可能是上述关键环节的关键分子。
现已证实在哺乳动物细胞中有三种类似的酶——PHD1、PHD2和PHD3，它们都含有α、β两个亚基，其中α亚基有脯氨酸羟化酶的活性。常氧时，PHD可将缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)-1α的两个脯氨酸残基羟基化，介导其被蛋白酶体降解。现已证实，PHD2是HIF-1α最重要的调控因子。此外研究发现，PHD2在多种肿瘤细胞系或肿瘤组织中表达缺失，提示其可能具有抑癌作用。目前已发现PHD2与肿瘤血管生成密切相关，且已证实肿瘤细胞能量代谢的改变早于肿瘤血管生成，那么PHD2是否在肿瘤糖酵解代谢方面发挥作用，目前还有待研究。本研究拟采用基因干扰重建、免疫共沉淀等现代分子生物学技术，以结肠癌细胞为研究对象，首先通过干扰或重建PHD2表达，观察肿瘤细胞在葡萄糖摄取、乳酸及能量分子生成等方面的相应变化，以明确PHD2对肿瘤糖酵解代谢的调控作用；进而研究主要能量相关通路在PHD2上述调控作用的活化情况，以期进一步阐明PHD2调控肿瘤糖酵解的分子机制。本研究不仅有助于加深对肿瘤糖酵解代谢机制的认识，而且能为针对肿瘤糖酵解的有效靶向治疗提供新策略。
明确PHD2对肿瘤糖酵解代谢的调控作用，进一步阐明PHD2调控肿瘤糖酵解的分子机制。
三、材料与方法
1.采用免疫组化、Western blot及定量PCR的方法检测人结肠癌组织及细胞PHD2及糖酵解相关蛋白的表达，并分析其相关性。运用Kaplan Meier生存曲线及多因素Cox模型分析PHD2在判断结直肠癌患者预后的临床价值。
2.采用RNA干扰、特异性抑制剂和基因过表达的方法，抑制结肠癌LS174T细胞PHD2及上调SW480细胞的PHD2，利用Western blot检测PHD2及糖酵解相关蛋白HK2、PDK1和Glut1的表达，采用液闪测量、酶标法、高效液相层析检测上述PHD2抑制或表达重建细胞的葡萄糖摄取量、乳酸生成量及ATP/ADP比值。利用Mitotracker检测细胞的线粒体数量。
3.采用液闪测量、酶标法、高效液相层析检测PHD2和HIF-1α双干扰LS174T细胞的葡萄糖摄取量、乳酸生成量及ATP/ADP比值。利用Western blot和ELISA检测抑制PHD2表达的LS174T细胞的LKB1/AMPK及IKK/NF-κB通路蛋白的活化情况。利用信号通路抑制剂结合液闪测量、酶标法、高效液相层析检测NF-κB通路抑制剂对PHD2抑制的LS174细胞糖酵解效应。利用免疫共沉淀判断NF-κB信号通路蛋白与PHD2的相互作用。
1. PHD2在结直肠癌组织中的表达显著低于正常结肠组织。所检测结肠癌肿瘤细胞仅LS174有稍高水平的PHD2表达，而其它细胞系均维持较低水平。结直肠癌组织中HK2、PDK1、Glut1mRNA表达水平与配对癌旁组织之间差异均有统计学意义。KaplanMeier生存分析表明PHD2低表达的早期结直肠癌患者预后显著差于高表达患者。多因素Cox模型分析发现，PHD2在结直肠癌患者中是一个独立的预后因素。
2. DMOG对结肠癌细胞LS174T细胞PHD2蛋白表达的抑制呈浓度依赖。利用DMOG处理LS174T细胞后可促进糖酵解。采用PHD2干扰质粒转染LS174T细胞后，其葡萄糖摄取量、乳酸产量以及ATP/ADP比值均显著增加。用PHD2过表达载体转染SW480细胞，Western blot检测发现过表达PHD2的SW480细胞的糖酵解相关分子包括Glut1、HK2、PDK1的表达均显著被抑制，其葡萄糖摄取量、乳酸产量以及ATP/ADP比值显著下降
3. HIF-1α抑制并不能影响PHD2对结肠癌细胞糖酵解活性的调控作用；NF-κB信号通路的活化参与PHD2对结肠癌细胞糖酵解的调控；磷酸化AMPK可随DMOG浓度的增加而上调。
1.PHD2在结直肠癌组织和细胞中的表达显著减少。PHD2可作为早期结直肠癌患者的预后指标。
2.PHD2对结肠癌糖酵解活性方面发挥关键的调控作用。
3.PHD2调控结肠癌糖酵解活性不依赖于HIF-1途径，而可能通过NF-κB途径，AMPK在其中的作用尚不明确。
【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R735.35【目录】：
中英文缩略语对照表6-9Abstract9-12摘要12-15前言15-17第一部分 PHD2 在结肠癌中的表达及其临床意义初步研究17-40 第一节 PHD 在结直肠癌组织中的表达及其临床价值18-28
材料与方法18-21
结果21-28 第二节 PHD2 在结肠癌组织及细胞系中的表达28-38
材料与方法28-35
结果35-38 讨论38-40第二部分 PHD2 对结肠癌细胞糖酵解活性的调控作用40-62 第一节 PHD2 与糖酵解相关分子在结肠癌的表达相关性研究41-44
材料与方法41-42
结果42-44 第二节 PHD2 调控结肠癌细胞糖酵解活性的实验研究44-60
材料与方法44-55
结果55-60 讨论60-62第三部分 PHD2 调控结肠癌细胞糖酵解活性的机制研究62-80 第一节 PHD2 对结肠癌糖酵解活性的调控不依赖于 HIF-1α63-68
材料与方法63-64
结果64-68 第二节 AMPK 可能参与 PHD2 对结肠癌糖酵解活性的调节作用68-72
材料与方法68-69
结果69-72 第三节 IKK/NF-κB 是 PHD2 调节结肠癌糖酵解活性的主要参与信号通路72-78
材料与方法72-75
结果75-78 讨论78-80全文结论80-81致谢81-82参考文献82-87文献综述87-98 REFERENCES93-98攻读博士期间发表的论文98-99
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B. Murray, S. V. Antonyuk, A. Marina, S. M. Van Liempd, S. C. Lu, J. M. Mato, S. S. Hasnain and A. L. Rojas
S-Adenosylmethionine (SAMe) is the principal methyl donor of the cell and is synthesized via an ATP-driven process by methionine adenosyltransferase (MAT) enzymes. It is tightly linked with cell proliferation in liver and colon cancer. In humans, there are three genes, mat1A, mat2A and mat2B, which encode MAT enzymes. mat2A and mat2B transcribe MAT2 and MAT enzyme subunits, respectively, with catalytic and regulatory roles. The MAT2 complex is expressed in nearly all tissues and is thought to be essential in providing the necessary SAMe flux for methylation of DNA and various proteins including histones. In human hepatocellular carcinoma mat2A and mat2B genes are upregulated, highlighting the importance of the MAT2 complex in liver disease. The individual subunits have been structurally characterized but the nature of the complex has remained elusive despite its existence having been postulated for more than 20 years and the observation that MAT is often co-localized with MAT2. Though SAMe can be produced by MAT(2)4 alone, this paper shows that the Vmax of the MAT2 complex is three- to fourfold higher depending on the variants of MAT that participate in complex formation. Using X-ray crystallography and solution X-ray scattering, the first structures are provided of this 258 kDa functional complex both in crystals and solution with an unexpected stoichiometry of 42 and 2V2 subunits. It is demonstrated that the N-terminal regulates the activity of the complex and it is shown that complex formation takes place surprisingly via the C-terminal of MATV2 that buries itself in a tunnel created at the interface of the MAT(2)2. The structural data suggest a unique mechanism of regulation and provide a gateway for structure-based drug design in anticancer therapies.有谁用过分子靶向治疗治结肠癌，效果明显吗？生物免疫治疗呢？_百度知道
有谁用过分子靶向治疗治结肠癌，效果明显吗？生物免疫治疗呢？
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KI是目前学术研究的前沿，有少数患者的效果是明显的，如KRAS分型决定爱必妥是否适用等，效果和患者本身的基因状态相关。所以，但是临床应用还要看具体人群筛选结果，所以必须有专业医生指导用药
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