碱基切除修复基因hMTH1，hOGG1和MUTYH变异与2型糖尿病发病风险的研究--《南京大学》2013年博士论文
碱基切除修复基因hMTH1，hOGG1和MUTYH变异与2型糖尿病发病风险的研究
【摘要】：机体在化学氧化剂或自由基等外界环境刺激下,或是正常细胞代谢过程中均能产生活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS),过量的ROS可造成细胞蛋白质,核酸和脂质大分子氧化损伤,破坏细胞氧化和抗氧化平衡状态,导致细胞功能失调。8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)是最常见DNA氧化损伤产物之一,在衰老和肿瘤的发生过程中起着重要作用。8-OHdG常作为氧化损伤的标志物之一。在DNA复制时,8-OHdG易于腺嘌呤(A)错配,造成G：C到T：A的颠换突变。人类mutT同源物1(human mutT homolog1, hMTH1),人类8-羟基鸟嘌呤糖基化酶(human8-oxoguanine glycosylase1, hOGG1)和人类mutY同源物(human mutY homolog, MUTYH)基因构成了8-OHdG修复通路的重要元件。
2型糖尿病(Type2Diabetes Mellitus, T2DM)是一个多因素引起的代谢性疾病,典型特征是胰岛素抵抗和／或胰岛素分泌异常。ROS参与胰岛素抵抗,β细胞受损,糖耐量减退并最终导致T2DM及其并发症发生发展的一系列过程。DNA修复基因的多态性变异会改变蛋白功能并降低DNA修复功能,进而引起基因组不稳定,增加年龄相关疾病的发病风险率。探讨DNA修复基因多态性变异和T2DM发病风险的关系可以加深对疾病的遗传学方面的理解,并可能会对糖尿病的预防提供新的途径。
本研究中,我们在年龄-性别匹配的T2DM病人和正常对照人群中进行hMTH1, hOGG1和MUTYH基因变异的筛查,探讨这些变异与T2DM发病风险的相关性。同时,在筛查T2DM病人hOGG1基因变异时发现了T2DM病人个别样本DNA疑似嵌合体状态,实验对其进一步的确认并探讨其对基因变异与疾病相关性分析的影响。
第一部分：hOGG1基因启动子区嵌合型变异的发现及对多态性变异与疾病风险相关性分析的影响
一、研究背景与目的
嵌合体是指一个生物体或组织内含有不同遗传信息的细胞系的存在,体细胞嵌合体通常是体细胞产生突变的结果,主要出现在胚胎发育早期。本实验在研究hOGG15'-UTR区C.-53GC (rs), c.-23AG (rs1801129)和c.-18GT (rs1801126)变异与T2DM发病风险相关性时,在突变基因测序分析中发现某些T2DM病人DNA样本突变等位基因峰值较低,本实验探讨其性质及对疾病相关的多态性分析结果的影响。
1.利用高分辨熔解曲线(High Resolution Melting, HRM)方法筛查T2DM病人和正常对照人群DNA样本中hOGG1基因5'-UTR c.-53GC, c.-23AG和c.-18GT多态性变异的基因型。
2.直接测序法确定筛查出的杂合型样本的多态性位点基因型。
3.PCR产物克隆测序技术分析测序图中有异常突变小峰的DNA样本变异频率并确定其性质。
4.焦磷酸测序技术和体外嵌合体模型确定嵌合体的存在。
1. hOGG1基因5'-UTR区c.-53GC变异的10.71%(3/28)、c.-23AG变异的13.73%(7/51)和c.-18GT的2.27%(1/44)呈现嵌合型的变异状态。
2.焦磷酸测序技术和体外嵌合体模型支持了以上分析结果。
3.病例-对照研究结合统计学分析发现,当嵌合型变异纳入杂合型变异,T2DM病人hOGG1基因5'-UTR区c.-23AG多态性变异频率显著高于正常对照组,且有统计学意义(OR:2.173;95%CI:1.329-3.554); hOGG1基因5’-UTR区c.-53GC或c.-18GT多态性变异频率在病人与对照中无显著性差异；按性别分组时,男性T2DM病人hOGGl基因5’-UTR区c.-23AG多态性变异频率也显著高于正常对照组,且有统计学意义(OR:2.828;95%CI:1.404-5.697),女性组中无差异性；按年龄分组(60或60岁),T2DM病人hOGG1基因5’-UTR区c.-23AG A/G杂合子频率显著高于正常对照组,且有统计学意义(OR：1.974,95%CI1.071-3.640；OR：2.573,95%CI：1.121-5.908)
4.当嵌合型变异不纳入杂合型变异,T2DM病人中hOGG1基因5’-UTR区c.-23AG多态性变异A/G杂合子频率改变,与正常对照组差异性减小；按年龄分组(60或60岁)时,T2DM病人hOGG1基因5'-UTR区c.-23AG A/G杂合子频率与正常对照组相比无显著性差异。
我们在筛查hOGG1基因5’-UTR区c.-23AG变异与T2DM发病风险关系时,在个别2型糖尿病患者DNA样本中发现hOGG1基因5’-UTR区嵌合型变异的存在。嵌合型的变异状态可能影响hOGG1基因5'-UTR区c.-23AG多态性变异的检出,影响疾病关联基因变异分析的结果。
第二部分：hMTH1, hOGG1和MUTYH基因多态性变异的联合作用与中国人群
2型糖尿病发病风险的研究
一、研究背景与目的
ROS参与T2DM及其并发症的发生发展过程。hMTH1, hOGG1和MUTYH构成了8-OHdG修复通路的重要元件。本研究中,我们在中国人群T2DM患者和一般对照人群中筛查了hMTH1p.Val83Met (c.247GA, rs4866)多态性变异,hOGG15'-UTR c.-53GC, c.-23AG和c.-18GT总变异,MUTYH AluYb8插入(AluYb8MUTYH, rs)变异,并且研究了这些变异及其联合作用与中国人群T2DM发病风险的关系。
1.利用HRM方法筛查T2DM病人和正常对照人群DNA样本中hMTH1c.247GA变异,hOGG1基因5’-UTR区c.-53GC, c.-23AG和c.-18GT多态性变异的基因型。
2.直接测序法测定HRM筛查出的hOGG1基因5’-UTR区c.-53GC, c.-23AG和c.-18GT变异的杂合型样本的多态性位点基因型。
3.凝胶电泳法对T2DM病人和正常对照人群DNA样本中AluYb8MUTYH变异基因型进行分型。
1. hMTH1c.247GA变异增加了大于55岁年龄组中国人群的T2DM发病风险(OR=1.579;95%CI:1.029-2.421)。
2. hOGGI5'-UTR区c.-53GC, c.-23AG和c.-18GT的总变异与中国人群的T2DM发病风险相关(OR=1.507,95%CI:1.122-2.024)。
3. AluYb8MUTYH变异与中国人群的T2DM发病风险相关(OR=1.229,95%CI:1.030-1.466)。
4.联合作用分析发现,hMTH1c.247GA与AluYb8MUTYH在增加T2DM发病风险方面存在协同效应(OR=1.635;95%CI:1.147-2.330);并且hOGG15'-UTR区总变异联合AluYb8MUTYH也可协同提高T2DM的发病风险(OR=1.804;95%CI:1.254-2.595)。
四、结论：
hMTH1, hOGG1, MUTYH基因多态性变异与中国人群的T2DM发病风险密切相关。本实验结果首次阐述AluYb8MUTYH变异与hMTH1c.247GA或hOGG15’-UTR区总变异在引起中国人群T2DM发病风险增高中存在协同关系。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：R587.1【目录】：
英文缩写与中文对照6-7中文摘要7-11英文摘要11-16前言16-24 参考文献19-24第一部分 hOGG1基因启动子区嵌合型变异的发现及对多态性变异与疾病风险相关性分析的影响24-61 1. 研究背景24 2. 材料与方法24-36
2.1 研究对象24-25
2.2 主要仪器和试剂25-26
2.3 外周血DNA提取26-27
2.4 hOGG1基因5’-UTR变异筛查27-28
2.4.1 引物设计27
2.4.2 hOGG1基因5'-UTR突变筛查27-28
2.5 hOGG1基因5'-UTR杂合子测序28-30
2.5.1 琼脂糖凝胶回收PCR产物28-29
2.5.2 Bigdye反应29
2.5.3 沉淀步骤29-30
2.5.4 测序30
2.6 PCR产物克隆,质粒提取与测序30-32
2.6.1 T载体与PCR纯化产物的连接30
2.6.2 转化30-31
2.6.3 质粒的提取与鉴定31-32
2.6.4 质粒测序32
2.7 焦磷酸测序32-34
2.7.1 前期样本处理32-33
2.7.2 分离单链33-34
2.7.3 退火34
2.7.4 上机34
2.8 体外嵌合体模型的建立34-35
2.8.1 体外嵌合体样本的制备34
2.8.2 体外嵌合体样本的测序验证34-35
2.9 引物hOGG1-F1与hOGG1-R1的变异鉴定35-36
2.9.1 引物设计35
2.9.2 直接测序法鉴定35-36
2.10 统计学方法36 3. 实验结果36-52
3.1 hOGG1基因5’-UTR突变筛查37-39
3.2 hOGG1基因5'-UTR区多态性位点嵌合型变异的检出39-43
3.3 hOGG1基因5’-UTR区多态性位点嵌合型变异的确认43-48
3.3.1 嵌合体样本焦磷酸测序结果43-46
3.3.2 hOGG1基因5'-UTR区c.-23A/G变异体外嵌合体模型46-47
3.3.3 引物hOGG1-F1和hOGG1-R1的测序鉴定47-48
3.4 嵌合型变异可影响hOGG1 5'-UTR区SNP检出频率48-52
3.4.1 嵌合体纳入杂合子变异时,病例与对照组中hOGG15’-UTR区SNP变异基因型频率分布48-49
3.4.2 嵌合体不纳入杂合子变异时,病例与对照组中hOGG15’-UTR区SNP变异基因型频率分布49-52 4. 讨论52-57 参考文献57-61第二部分 hMTH1,hOGG1和MUTYH基因多态性变异的联合作用与中国人群2型糖尿病的发病风险的研究61-80 1. 研究背景61 2. 材料与方法61-67
2.1 研究对象62
2.2 主要仪器和试剂62-63
2.3 外周血DNA提取63
2.4 hMTH1基因c.247G>A突变筛查63-65
2.4.1 引物设计63
2.4.2 HRM筛查hMTH1基因c.247G>A突变63-64
2.4.3 酶切验证64-65
2.4.4 测序验证65
2.5 hOGG1基因5'-UTR变异筛查65
2.5.1 引物设计65
2.5.2 hOGG1基因5'-UTR突变筛查65
2.5.3 测序验证65
2.6 MUTYH基因AluYb8插入筛查65-66
2.6.1 引物设计65-66
2.6.2 电泳凝胶法筛查MUTYH基因AluYb8插入突变66
2.7 统计学方法66-67 3. 实验结果67-73
3.1 病例-对照组hMTH1,hOGG1和MUTYH基因多态性研究67-71
3.1.1 病例-对照组中hMTH1 c.247G>A多态性变异基因型频率分布69-70
3.1.2 病例-对照组中hOGG1 5'-UTR区c.-53G>C,c.-23A>G和c.-18G>T的总变异基因型频率分布70
3.1.3 病例-对照组中AluYb8MUTYH变异基因型频率分布70-71
3.2 hMTH1,hOGG1和MUTYH基因多态性变异联合作用与T2DM发病风险相关性71-73 4. 讨论73-76 参考文献76-80结论80-82综述82-103 参考文献92-103博士期间发表论文103-104致谢104-105
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应用引物特异性实时荧光PCR法检测HBVYMDD自然变异的研究
本研究分为两部分：①HBV DNAYMDD、YVDD和YIDD标准质粒的构建及三种常用HBV YMDD变异检测方法的评估；②未经抗病毒治疗的慢乙肝患者HBV YMDD自然变异株的流行病学研究。
第一部分HBV DNA YMDD、YVDD和YIDD标准质粒的构建及三种常用HBV YMDD变异检测方法的比较。
目的：构建HBV DNA YMDD、YVDD和YIDD三种质粒，为评估YMDD变异检测方法提供标准品；对目前临床应用较为广泛的三种YMDD变异株检测方法进行评估，确定一种操作简便、易于临床开展的YMDD变异株检测方法。
方法：PCR扩增HBV DNA包含YMDD的P基因片段，通过T/A克隆法构建重组质粒并加以鉴定，通过紫外分光光度计及荧光定量PCR对标准质粒进行定量。以不同比例混合的质粒样本、LAM治疗过程中出现表型耐药及部分未经抗病毒的慢性乙型肝炎患者血清为研究对象，通过对混合质粒的直接测序、探针特异性实时荧光PCR技术灵敏度、特异性的检验及引物特异性实时荧光PCR技术特异性及相对定量的验证，比较三种常用突变检测技术对变异株的检出能力。
结果：获得YMDD、YVDD及YIDD三种质粒，通过测序鉴定明确插入片段的序列与预期一致。不同比例(YIDD和YVDD标准质粒)混合的质粒的测序结果：对于YIDD或YVDD质粒占总质粒25％以下时，直接测序法不易检出。单探针(野生型探针)特异性实时荧光PCR技术灵敏度的检验：当野生型模板与突变模板的比例为1：5时，因为Ct值为33.11，此时还不能得出该样品为变异型(根据判断标准)，但实际上该混合模板中的突变模板已约占5/6；当野生型模板与突变模板的比例为1：10时，Ct值>40，可以判断该样品为HBV DNAYMDD变异型，此时该混合模板中的突变模板已约占10/11。显示该检测易造成假阴性。双探针(野生型及突变型探针)特异性实时荧光PCR技术表明，当野生型模板与突变模板的比例为10：1时，由扩增曲线得出野生模板与突变模板比例约为50：1，与实际比例不符。在引物特异性实时荧光PCR技术特异性的检验过程中，当突变株占总毒株的比例高于1/11时，该技术的特异性比较高，非特异性扩增不影响实际检测结果。在验证引物特异性实时荧光PCR技术相对定量中，随着变异株在总毒株中的比例逐渐降低，ΔCt值也逐渐增大，YIDD毒株在总病毒量中的比例是1/11时，ΔCt值为3.67，当YVDD毒株在总病毒量中的比例是1/11时，ACt值为3.48。临床验证中显示，105例拉米夫定表型耐药者，直接测序法检出97例YMDD变异(92.38％)，引物特异性实时荧光PCR检出95例YMDD变异(90.48％)，20例样本用单探针(野生型探针)特异性实时荧光PCR法检出9例YMDD变异(45.00％)；110例未经抗病毒者，直接测序法检出1例YMDD变异(0.91％)，引物特异性实时荧光PCR检出11例YMDD变异(10.00％)，20例样本用单探针(野生型探针)特异性实时荧光PCR法未检出YMDD变异。
结论：PCR产物直接测序法、探针特异性荧光PCR技术以及引物特异性实时荧光PCR技术均可用于YMDD变异的检测。直接测序法能够检测出优势模板，但当某模板占总模板的低于一定比例(约25％)时，难以对是否混合该模板以准确判定；探针特异性荧光PCR技术能够检测出优势模板，单探针技术(野生型探针)易造成假阴性，同时PCR竞争抑制及探针的非特异性结合会影响变异株检出的准确性；引物特异性荧光PCR法避免了竞争抑制的影响，当突变株占总毒株的比例高于1/11时，具有很好的特异性，通过确定合理的ΔCt标准值，可判定是否存在突变株，同时可根据检测中的实际ΔCt值对突变株进行相对定量。【
第二部分未经抗病毒治疗的慢乙肝患者HBV YMDD自然变异株的流行病学研究。
目的：了解‘YMDD自然变异的发生情况及影响YMDD自然变异的因素。
方法：收集196例从未使用过抗病毒治疗的慢性乙肝患者的血清，采用引物特异性实时荧光PCR方法检测YMDD变异；分析性别、年龄、病毒载量、e抗原状态、疾病状态、病程、HBV基因型，通过t检验、卡方检验、Fish’s检验及Logistic回归分析，判断影响YMDD自然变异检出率的因素。
结果：在196例未采用抗病毒治疗的慢性乙肝患者中，检出21例YMDD自然变异者(10.70％)，其中YIDD阳性者1例，YVDD阳性者20例；变异毒株占总毒株超过50％者1例，25％至50％者5例，9％至25％者15例。在196例CHB患者中，有182例进行了HBV基因分型，其中B基因型60例(30.61％)，C基因型122例(62.24％)。单因素分析：B基因型病例中，YMDD变异毒株的检出率(20.00％，12/60)显著高于C基因型者(7.38％，9/122)，P=0.0122。多因素分析：仅HBV基因型进入回归模型，患者性别、年龄、HBeAg状态、HBV DNA载量、疾病状态未进入回归模型。
结论：在CHB患者中存在YMDD自然变异毒株；YMDD自然变异的发生率与患者性别、年龄、HBeAg状态、HBV DNA载量、疾病状态、病程无显著关系，B基因型病例比C基因型病例更易检测出YMDD自然变异株。
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