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【求助】血液中提取总RNA
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这个帖子发布于2年零295天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
论坛里有没有前辈用红细胞裂解液来提白细胞的。之前有处理过一批人骨髓的标本，用红细胞裂解液提的白细胞后，加入1000UL
TRIZOL ，放入-80℃保存。积累了一批标本之后整体提RNA，逆转录，电泳。最后做的PCR，可是PCR出来的结果一直很不理想。想请教前辈，用裂红提取白细胞这一个过程是需要无酶操作的吗？还没加TRIZOL裂解白细胞之前，细胞里面的RNA会被降解吗？网上有查到一站式提取血液中总RNA的试剂盒，不知有没有前辈用过，这种方法成熟吗？有没有资料可以比较一下这些方法提出的RNA的质量？能不能给点意见，我们有没有必要换一种提RNA的方法呢？
不知道邀请谁？试试他们
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我还能飞翔 师姐的意思的临床上的标本很珍贵，为了节省标本的损耗，建议我们不跑RNA...前辈，有没有自己做过的提取骨髓血或外周血中总RNA的方法提供参考呢?当时我们提取的是外周血的总RNA，感觉提取的质量要比组织的RNA还要差一些。所以我才建议你第一次提的时候跑RNA既然标本这么珍贵，为何不用非标本血液提下RNA练习下基本技术呢如果之前你们师姐按这种方法已经成功提取过RNA并扩增，这就没问题但是如果仅仅停留在理论阶段，建议还是试试不然实验不顺利，根本不知道哪个环节出了问题
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Trizol LS Reagent其实成分和Trizol Reagent是一样的，只是因为处理的是液体样本，所以把Trizol的成分浓缩了一下，这个Trizol LS Reagent优势就在于这是一种大品牌，国际通用哈哈，很多人都用，国内的试剂可能效果也差不多，只不过总给人一种不可靠的感觉。
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还有很多战友提到的淋巴细胞分离液是怎么用的呢？跟红细胞裂解液有什么差别？
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RNA会降解的，尤其是血液取样的时候杂质较多，需注意无酶操作试剂盒只是使用方便，效果未必比试剂好低温保存的样本仍有降解可能，尤其是反复解冻建议提出来后跑跑rna，看看条带怎么样，这样可以排除逆转录出问题的可能性
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分离白细胞的试剂或塑料耗材是否无酶对提取无影响，因为细胞内本身有大量内源RNase，只要细胞未破裂，外源RNase无法降解RNA。但是分离白细胞过程不可避免的会损伤细胞，这就激活了内源RNase造成降解，另外分离白细胞过程也会导致某些基因mRNA丰度发生变化，因为这个过程已经不是生理状态了。我们公司有血液RNA提取的Kit(目录号RK206)，全血(不是白细胞)直接加入2.5倍试剂，室温放置2小时，这个过程缓慢裂解所有细胞(包括白细胞)，试剂中含阳离子多聚物能屏蔽DNA和RNA的负电荷，使DNA和RNA析出，与RNase隔离。每毫升血液产量约3-8ug RNA。如果不立即提取RNA，可以室温放置24小时，4度放置1周，-20度长期保存。
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wenzi7520 RNA会降解的，尤其是血液取样的时候杂质较多，需注意无酶操作试剂盒只是使用方便，效果未必比试剂好低温保存的样本仍有降解可能，尤其是反复解冻建议提出来后跑跑rna，看看条带怎么样，这样可以排除逆转录出问题的可能性您的意思是在提取出RNA之后可以跑一跑胶，看看条带吗？我们实验室的师姐之前做的时候都是在逆转录出cDNA之后跑的胶。这样子有什么差别呢？
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zcldf001 分离白细胞的试剂或塑料耗材是否无酶对提取无影响，因为细胞内本身有大量内源RNase，只要细胞未破裂，外源RNase无法降解RNA。但是分离白细胞过程不可避免的会损伤细胞，这就激活了内源RNase造成降解，另外分离白细胞过程也会导致某些基因mRNA丰度发生变化，因为这个过程已经不是生理状态了。我们公司有血液RNA提取的Kit(目录号RK206)，全血(不是白细胞)直接加入2.5倍试剂，室温放置2小时，这个过程缓慢裂解所有细胞(包括白细胞)，试剂中含阳离子多聚物能屏蔽DNA和RNA的负电荷，使DNA和RNA析出，与RNase隔离。每毫升血液产量约3-8ug RNA。如果不立即提取RNA，可以室温放置24小时，4度放置1周，-20度长期保存。
有没有文献提供，可以比对一下你们的试剂跟传统的全血中提RNA方法的效果？跟传统全血提RNA方法相比，你们试剂的优势主要体现在哪些方面？
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外界环境中有许多RNA酶，血液中更多，所以您必须先检查您RNA的效果，只要看1，是否有拖带，2，看条带是否清晰。然后在反转，不然好可惜
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直接跑RNA，这样可以观察到RNA的质量，然后决定是否进行逆转录。这样可以节省人力和财力
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1 不建议跑电泳,即使电泳了,也未必看到得到,因为全血提取的RNA量很少,替代方法,可以试用RT-PCR验证2 红细胞裂解液中的成分会影响得率3 可以将100ul骨髓加1mltrizol直接混匀后保存于-20度提取,效果不错,可以一试
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wenzi7520 直接跑RNA，这样可以观察到RNA的质量，然后决定是否进行逆转录。这样可以节省人力和财力我跟师姐说过，想要先跑一下RNA，看看RNA质量怎么样，再决定是否逆转录。但是因为我们做的是临床上病人骨穿后取的骨髓血，病人的标本都是很珍贵的，所以师姐建议我要跑RNA可以拿养的细胞来跑。师姐说如果细胞的RNA跑出来结果是好的，就可以了。但我觉得每个病人是不一样的，而且骨穿的标本是临床上给的，我们实验组的人，并没有在临床上，所以拿到标本的时候，一般都是骨穿过了好几天之后了的。虽然我们提RNA用的是相同的方法，但提出来的RNA的质量，对每个病人而言，都是不完全一样的。
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wowwww 外界环境中有许多RNA酶，血液中更多，所以您必须先检查您RNA的效果，只要看1，是否有拖带，2，看条带是否清晰。然后在反转，不然好可惜师姐的意思的临床上的标本很珍贵，为了节省标本的损耗，建议我们不跑RNA...前辈，有没有自己做过的提取骨髓血或外周血中总RNA的方法提供参考呢?
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guoxingzhong 1 不建议跑电泳,即使电泳了,也未必看到得到,因为全血提取的RNA量很少,替代方法,可以试用RT-PCR验证2 红细胞裂解液中的成分会影响得率3 可以将100ul骨髓加1mltrizol直接混匀后保存于-20度提取,效果不错,可以一试有没有什么方法可以尽量减少红细胞裂解液对得率的影响呢？
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有没有哪位前辈有自己提取过骨髓血或外周血中总RNA，能否将您的方法供给我参考一下呢？
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我还能飞翔 师姐的意思的临床上的标本很珍贵，为了节省标本的损耗，建议我们不跑RNA...前辈，有没有自己做过的提取骨髓血或外周血中总RNA的方法提供参考呢?当时我们提取的是外周血的总RNA，感觉提取的质量要比组织的RNA还要差一些。所以我才建议你第一次提的时候跑RNA既然标本这么珍贵，为何不用非标本血液提下RNA练习下基本技术呢如果之前你们师姐按这种方法已经成功提取过RNA并扩增，这就没问题但是如果仅仅停留在理论阶段，建议还是试试不然实验不顺利，根本不知道哪个环节出了问题
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我还能飞翔 有没有哪位前辈有自己提取过骨髓血或外周血中总RNA，能否将您的方法供给我参考一下呢？我们经常提取的，我上面描述的方法比较可靠的，全血最多加150ul/1ml Trizol，不必裂解红细胞
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guoxingzhong 我们经常提取的，我上面描述的方法比较可靠的，全血最多加150ul/1ml Trizol，不必裂解红细胞赞成！！Trizol说明书上明明白白写着可以这么操作的，方法简单可靠，但是那个Trizol要注意了，其具体型号是Trizol LS Reagent，专门用来处理液体样本的，这种方法尤其适用于小体积样本，方法越简单越好，出错的机会越少。
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taccycle 赞成！！Trizol说明书上明明白白写着可以这么操作的，方法简单可靠，但是那个Trizol要注意了，其具体型号是Trizol LS Reagent，专门用来处理液体样本的，这种方法尤其适用于小体积样本，方法越简单越好，出错的机会越少。Trizol LS Reagent优势在哪里？用过国内的，差不多
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Trizol LS Reagent其实成分和Trizol Reagent是一样的，只是因为处理的是液体样本，所以把Trizol的成分浓缩了一下，这个Trizol LS Reagent优势就在于这是一种大品牌，国际通用哈哈，很多人都用，国内的试剂可能效果也差不多，只不过总给人一种不可靠的感觉。
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关于丁香园RNA提取问题(降解,液氮,研磨) - PCR实验 - 生物秀
标题: RNA提取问题(降解,液氮,研磨)
摘要: [RNA提取问题(降解,液氮,研磨)] 各位用液氮研磨组织后怎么将组织粉末和TRIZOL混合的？我是用小勺把粉末转移到EP管里，然后加入TRIZOL的，但是组织粉末总是会贴住管壁，加TRIZOL后很难混匀，有时我会拿枪头刮一下管壁，这样做有时提出的RNA没有降解，但有时就会降解。最近以一段时间提的就不好。请问大家有没有更好的把办法？ 关键词:[降解 液氮 研磨]……
各位用液氮研磨组织后怎么将组织粉末和TRIZOL混合的？我是用小勺把粉末转移到EP管里，然后加入TRIZOL的，但是组织粉末总是会贴住管壁，加TRIZOL后很难混匀，有时我会拿枪头刮一下管壁，这样做有时提出的RNA没有降解，但有时就会降解。最近以一段时间提的就不好。请问大家有没有更好的把办法？
回复最好先加TRIZOL，然后用个枪头把小勺中的粉末挑进去，在里面搅动一下就OK了！用液氮研磨只能细心点了回复液氮研磨组织后在研钵中加入Trizol,充分研磨后再转入EP管中，吹打混匀，进行下一步操作。回复液氮研磨组织后在研钵中加入Trizol,充分研磨后再转入EP管中，吹打混匀，进行下一步操作。我们采用的也是类似的方法。或者去买个匀浆器吧，加了样品和Trizol一起磨，效果会好很多。回复同意楼上的，去买个匀浆器，样品和Trizol一起搞，步骤：1.取50-100mg新鲜组织，加Trizol 1ml，冰上匀浆。2.将匀浆样品孵育5min，15-30oC。每1ml Trizol 加0.2ml氯仿。剧烈振摇（充分混匀）20S*3次，放置2-15min，15-30oC。离心12000rpm*15min(4oC)回复崔周军楼上的，去买个匀浆器，样品和Trizol一起搞，步骤：1.取50-100mg新鲜组织，加Trizol 1ml，冰上匀浆。2.将匀浆样品孵育5min，15-30oC。每1ml Trizol 加0.2ml氯仿。剧烈振摇（充分混匀）20S*3次，放置2-15min，15-30oC。离心12000rpm*15min(4oC) 请问组织在加Trizol 1ml前，要不要先对其进行小块处理，否则一块组织直接在Trizol中是不是匀浆时间比较长啊？回复我们用的是电动，没有你说的这种问题，不过我觉得你如果手动匀浆的话还是先把组织小块处理后在匀浆要好些，这样要省事的多回复我们的方法，如同3楼，一般组织，只要操作规范，损失不大，我们做最小的如小鼠阴道，那么点，都没太大损失，所以应该不用担心得率回复液氮研磨组织后在中加入Trizol,充分研磨后再转入EP管中，吹打混匀，进行下一步操作。三楼的方法我试过，但把trizol加到以后，由于太冷了trizol马上就变成固体了，请问后来你是怎么做的，等其自然溶化后装入直管，中间有无什么保护措施。回复由于温度很低，Trizol是会很快凝集呈类似于凝胶状，继续研磨片刻，使组织与Trizol更充分的接触，也会抑制RNA酶的降解。待Trizol与组织化为液体后，用加样枪转入EP管，尽量将研钵中的液体抽吸干净。回复电动匀浆器的效率要比液氮研磨效率高，如果经济允许，建议用匀浆器。祝好运！回复三楼的方法我试过，但把trizol加到研钵以后，由于太冷了trizol马上就变成固体了，请问后来你是怎么做的，等其自然溶化后装入直管，中间有无什么保护措施。后面你可以再加点液氮，让TRIZOL变硬变脆，然后继续研磨，把trizol也研磨成粉末，然后等全部溶解后，吸到EP管中。这样提取RNA降解很少。回复三楼的方法我试过，但把trizol加到研钵以后，由于太冷了trizol马上就变成固体了，请问后来你是怎么做的，等其自然溶化后装入直管，中间有无什么保护措施。对呀，直接冻成固体了，然后等熔化后，就可以直接用枪移入管中，不需要保护措施，当然我们是比较洁净独立的房间里完成的回复其实没必要那么费劲的,提RNA其实是很常规的技术,你越在意就越提不好,如果你实验室有分散机,直接将样品加在TRIZOL里面一起破碎就OK了,方便快捷,建议不妨试试!
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【求助】脑经急转弯：提RNA时误将第一步的三氯甲烷加成了异丙醇会怎么样？
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这个帖子发布于5年零89天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
如题。接下来的离心会把rna离心到沉淀里去么？
不知道邀请谁？试试他们
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RNA会被离心出来的，只是会杂质很多，蛋白很多。
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林黎 RNA会被离心出来的，只是会杂质很多，蛋白很多。接着往下做后，重新加三氯甲烷依旧可以分层，但是取出的上清再沉淀几乎没有沉淀，且上清变成了淡粉色。窃以为，既然异丙醇可以沉淀RNA,DNA，蛋白质，第一步误加可以把三者赖以溶解的环境都破坏掉，最后的结果就是重新加三氯甲烷并离心后，RNA，DNA都在中间的白膜层，DNA沉淀是否完全不知道，但RNA一定被沉淀了，剩下的水相没有东东。蛋白质，大概因为异丙醇不够，并且异丙醇更愿意待在水相，所以沉淀得少。血的教训，20ml血保存成的10管RNA全部壮烈牺牲，保持清醒很重要。说得不对请各位指点。
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挖下坟不好意思。前天我也遇到这问题，但是样品只有1管，只好硬着头皮往下做看了这帖子后，我就做了下实验先继续加氯仿，然后吸取上清，置于离心管A，继续抽。抽出来的RNA有颜色，估计杂质比较多。然后尽量去除剩余上清，把中间层吸出来（应该会吸到部分有机相），置于离心管B，重新加入trizol，混合后继续抽。加氯仿混合后分层很慢，要等一会儿。之后离心取上清溶液也有颜色，但加异丙醇离心沉淀出来的RNA颜色比A管白了。2管都加了糖原共沉淀。之后2管RNA用酒精清洗要认真点。抽出来的结果A管浓度525ng/ul260/280 1.96260/230 1.75B管浓度955ng/ul260/280 2.00260/230 2.11电泳图如下图，左边是A管的，右边是B管的明显B管质量比较高。看来RNA是在中间层。如果没有剩余样品，而出错样品中RNA量多的话可以这样尝试补救一下。或许会有好结果也说不定？
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今天也脑残了一回，第一步就加了异丙醇，全部加完才发现怎么没有分层，后来硬着头皮做下去了，参考了楼上这位师兄的做法，分了两管出来，相当于第一管是第一步多加了异丙醇，后面依旧按照说明书往下做，第二管是把中间蛋白层吸出来重新加氯仿也一样照步骤做下去，结果我的A管质量明显比B管要好，也不知道为啥子~
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貌似结果还凑合嘛！如果有一种方法完全不用这些步骤呢？ 我们有一款产品哦，处理完细胞后就可以直接RT了，根本不要任何中间步骤！
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请问有用TRIzol提全血RNA的吗，我是先用红细胞裂解液进行裂解后再提的，可一直提不出来啊，请问可以使用红细胞裂解液吗
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如何快速简单的保存提取全血RNA
北京艾德莱生物在用血液标本进行基因表达研究时，需要及时把新鲜血液中有核细胞的RNA提取出来。全血还不能直接放到-80℃保存，即使在-80℃保存，全血中的RNA也容易发生降解。传统的提取新鲜全血RNA方法是把先把有核细胞从全血中分离出来，需要加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐，在临床医院往往难以实施。作为RNA提取的领先公司，北京艾德莱的研发人员在05年国内首家研发成功液体样本RNA提取试剂RN02 TRIpure LS(LS 意思是Liquid Sample)可以直接裂解全血提取RNA，避免了先裂解白细胞可能导致的RNA降解，也大大简化了操作步骤。操作时间比普通方法节约至少三分之一。在临床上采血时，可以先把TRI pure LS Reagent分装750ul到1.5ml的离心管中。血液样本可以先抗凝处理（EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可），然后取250ul全血样品加入到750ul的TRI pure LSReagent中，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min-10min，直至血细胞充分发生裂解。然后可把此裂解液保存在-20℃下可达2个月，-80℃可达半年。在此期间，可以把该裂解液运输到北京艾德莱生物公司进行RNA的抽提，运输过程可以4℃ 1天，-20℃一周。在全血RNA提取试剂直接裂解全血的基础上面，北京艾德莱又进一步简化了操作，增加了离心柱操作，推出了RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒。经过离心柱子吸附漂洗，除了进一步简化了操作步骤外，更适合临床高通量操作外，还极大的提高了RNA的纯度。除了一般常见的RT PCR 或者荧光定量PCR外，RNA纯度可以满足最严格的实验要求比如基因表达谱芯片要求， 1ml的全血可以得到10μg左右的total RNA，足够满足芯片分析的需要。[img=136,180]file:///C:/Users/maozhang/AppData/Local/Temp/msohtml1/01/clip_image002.jpg[/img]
图1 泳道1与3，在-80度保存一个月后的提取结果。泳道2与4 新鲜血液提取结果。
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saylav 今天也脑残了一回，第一步就加了异丙醇，全部加完才发现怎么没有分层，后来硬着头皮做下去了，参考了楼上这位师兄的做法，分了两管出来，相当于第一管是第一步多加了异丙醇，后面依旧按照说明书往下做，第二管是把中间蛋白层吸出来重新加氯仿也一样照步骤做下去，结果我的A管质量明显比B管要好，也不知道为啥子~
给个Thermofisher的处理方法If
isopropanol is inadvertently added at this step instead of chloroform,
add more isopropanol to precipitate everything, then resuspend the
pellet in TRIzol(R) Reagent and use the protocol as specified. RNA yields
will be compromised, but it may be possible to obtain a product in
downstream RT-PCR. Here is the detailed protocol:1. Add more isopropanol so that the total volume of isopropanol equals
the volume of TRIzol(R) Reagent used. Centrifuge at 7,500 x g for 10
minutes at 4°C.2. P allow relatively compacted pellet to air-dry
(doesn't have to be completely dry, just reduce the volume of
ispropanol).3. Estimate the size of the p add at least 15–20
volumes of TRIzol(R) Reagent (e.g., for a 100 μl pellet, add at least 1.5
mL TRIzol(R) Reagent).4. Break the pellet up well (you may have to use a hand-held
homogenizer). Store the solution for 10–15 minutes
every 5 minutes or so, shake it by hand to make certain it is well
dispersed.5. Proceed with the TRIzol(R) protocol as written (i.e., add chloroform).
Results will not be optimal, but it may be possible to obtain a product
in RT-PCR.Alternatively, add 2 additional volumes of TRIzol(R) Reagent to make up
for the added volume, and then add more chloroform based on the total
volume of TRIzol(R) Reagent. This method is quicker, but will yield more
DNA contamination of the RNA.
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medqyq edited on
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RNA提取常见问题分析
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