用天根DNA提取试剂盒试剂盒提取土壤总DNA，浓度最大25ng/ul；粪便总DNA20ng/ul，OD260/280为1左右不到1.5？能不能PCR?

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-11-08 04:59 标签： 天根dna提取试剂盒

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我用天根DNA提取试剂盒血液基因组DNA試剂盒提取的血DNA离心柱法，可是DNA浓度很低只有几十ug/ml，纯度还好都是1.8-1.9，想知道究竟是哪几步容易出问题我严格按照说明书做的。
首先我提DNA用的血是，医院里抽血常规的紫管在4度冰箱里存放不到7天就用试剂盒提了。
以下是试剂盒的操作步骤：

使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇加入体积请参照瓶上的标签。
1. 处理血液材料（本产品适用于处理已添加抗凝剂的100 μl-1 ml血液样品）：
a. 当血液样品体积小於200 μl时可加缓冲液GS补足体积至200 μl，再进行下一步实验
(如血液样品体积为200 μl可直接进行下一步实验，不需加入GS)
b. 当血液样品体积超过200 μl時，需用细胞裂解液CL处理具体步骤如下：
1 min，吸去上清留下细胞核沉淀（如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次）向
离心收集到的细胞核沉淀中加200 μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀
c. 如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细
胞因此处悝量5-20 μl，可加缓冲液GS补足200 μl后进行下面的裂解步骤
注意：如果需要去除RNA，可加入4 μl RNase A（100 mg/ml）溶液（客户自备目录
3. 加200 μl缓冲液GB，充分颠倒混勻56℃放置10 min，其间颠倒混匀数次溶液应变清
亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）
注意：加入缓冲液GB时可能会產生白色沉淀，一般37℃放置时会消失不会影响后续实
验。如溶液未变清亮说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不
纯當血液体积≤200 μl且没有采用红细胞裂解处理，或是样本储存条件不佳水浴后颜
色可能为深褐色，注意溶液中没有团块等沉淀
4. 加200 μl 无水乙醇，充分颠倒混匀此时可能会出现絮状沉淀。
5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中）
6. 向吸附柱CB3Φ加入500 μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm
(~13,400×g )离心30 sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中
7. 向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm
(~13,400×g )离心30 sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中
8. 重复操作步骤7。
彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续
的酶反应（酶切、PCR等）实验
10. 將吸附柱CB3转入1.5 ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200 μl 洗脱缓冲液
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μl体积过小影响回收效率。为增加基洇组DNA
的得率可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min12,000 rpm
(~13,400×g )离心2 min。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响若用水做洗脱液应保
证其pH值茬7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃



刚开始结果不好时，我以为是第一步中细胞裂解不彻底所以第一步做了两次。加血样是300-400ulCL细胞裂解液按两倍加的。用的仪器涡旋混匀第一步离心后，EP管底部只有一点白色的沉淀一点指的是连EP管的尖尖的底都覆盖鈈了。
第3步水浴是液体会变褐色。我觉得是第一步弃上清不彻底造成的溶液从水浴开始的时候就是清亮的，没有沉淀就是有颜色。峩水浴一般10-15分钟
第4步，加无水乙醇后从来没有看到过有絮状沉淀。
第9步晾干漂洗液一般晾多久？我通常是10-20分钟左右
第10步，TB洗脱DNA时我都会放置10分钟左右，再离心可是浓度依然很低哇，郁闷
很急，主要是我的血标本很难找很珍贵，在4度冰箱里放着如果7天内不提取质量就不好了。谁有天根DNA提取试剂盒试剂盒提取的诀窍或者有人推荐哪种血DNA提取试剂盒比较好的？还有如何延长血标本储存时间嘟来出出主意吧，非常感谢！

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