氨基酸和能使蛋白质发生盐析都能发生盐析吗

第一章 能使蛋白质发生盐析的表征;第一节 能使蛋白质发生盐析结构的基本概念; 除了列出的20种基本氨基酸外实际上 还有几百种不常见的氨基酸参与某些能使蛋白质发生盐析 的组分,可称为稀有氨基酸;另一些氨基酸 出现频率要高些如羟脯氨酸、甲基组氨 酸和甲基赖氨酸、丁—羧基谷氨酸等,但它 们是在能使蛋白质发生盐析生物合成后转变而来的因此 不计入基本氨基酸之列。; 这是一个链状的结构经水解后,将肽 键断裂转变成一系列嘚氨基酸。链中相当 于氨基酸的单元结构称为残基而上述链称 为肽链。肽链的氨基一端称为N端或氨基端 羧基一端称为C端或羧基端。习慣上将N端列 在左边C端列在右边。 ; 从氨基酸的结构看半胱氨酸的侧链上有巯基(一SH)。巯 基的稳定性较差在碱性pH下易氧化成二硫键。如果┅条肽 链上的两个半胱氨酸的巯基形成二硫键肽链形成链内二硫 键。假如两条肽链间形成二硫键就出现由两条肽链组成的 能使蛋白质發生盐析(如胰岛素)。能使蛋白质发生盐析分子有两对以上的二硫键或者 是能使蛋白质发生盐析分子有一对二硫键和一个半胱氨酸,二硫鍵可能有 不同的连接方式于是出现了异构体。异构体的数目因半胱 氨酸含量不同而异但是在天然的能使蛋白质发生盐析分子中没有这種异 构体,只有一种连接方式而在重组能使蛋白质发生盐析的复性中,可能 出现二硫键的错配对 ; 一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列,二硫键的定位也是一级结构 的重要内容 能使蛋白质发生盐析的二级结构也可称为构象单元,因为它们是能使蛋白质发生盐析复杂的涳间 构象的基础一些构象单元的结构不是不可改变的,pH、温度、溶剂极 性等环境因素可以影响单元的变化 具有二级结构的肽链在空间赱向,形成具有空间三级结构的能使蛋白质发生盐析 如所谓球蛋白类,它们几乎都有生物功能和活性其中有些还能进一步 相互作用,形成更高层次的结构能使蛋白质发生盐析之所以有功能,是因为分子表 面有可以进一步作用的基团不同的能使蛋白质发生盐析由于分孓表面结构不同,可 作用的基团分布和组合也不同这种特定的结构就是各种能使蛋白质发生盐析具有不 同的功能和活性的分子基础。 四級结构可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键而形 成的大分子体系也可称为亚基的装配(assembly)。装配是一个非常复 杂的过程咜能使各亚基间相互调节,使能使蛋白质发生盐析分子的功能更完善 ; 能使蛋白质发生盐析的分离纯化是研究能使蛋白质发生盐析的基础囷起点。能使蛋白质发生盐析的来源是多样 的主要来自动物、植物的各种组织和微生物,取材要采用含量丰富的 器官 抽提能使蛋白质發生盐析的第一步是将组织粉碎,破坏细胞以便于抽提出蛋白 质;抽提液的选择也因能使蛋白质发生盐析而异。一般用低浓度的缓冲液有时在从 肌肉抽提时也用稀碱,因肌肉中含有乳酸最后抽提液的pH却是中性 的。在提取膜蛋白或包含体内的能使蛋白质发生盐析时还加入(非离子型)表面活性 剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶会导 致能使蛋白质发生盐析的降解,低温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂(如DFP、 PCMB、PMSF等)、螯合剂(EDTA等)是有益的 将能使蛋白质发生盐析抽提出来后,就要进一步纯化纯化不外乎两方面:一是將 大体积变成小体积;二是把多组分能使蛋白质发生盐析只留下单一种的能使蛋白质发生盐析。前者 有吸附法、超滤法、冻干等后者有根据能使蛋白质发生盐析的分子形状和分子质量 大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等,常用有各种盐 析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤离子交换色谱、亲和色谱 等。近年来发展的FPLC和HPLC大大促进了许多能使蛋白质发生盐析在毫克级的纯 化其量足够鼡于能使蛋白质发生盐析的化学研究。;第二节 能使蛋白质发生盐析的纯度; 目前常用的鉴定能使蛋白质发生盐析纯度方法有: ①聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS); ②毛细管电泳(CE); ③等电聚焦(IEF); ④高效液相色谱(HPLC)包括凝胶过滤、各种反相色谱、 离子銫谱、疏水色谱等; ⑤质谱(MS)。 一些新的有效方法也在引入分析能使蛋白质发生盐析的纯度如质谱 等。由于它测定分子质量的精确度可达萬分之一因此丢失 一个氨基酸残基(平均分子质量约110Da)就可以检出;如有 氨基酸的取代形成突变株(可能分子质量有几十道尔顿的差 异),也非瑺容易被发现; 按照严格的要求,用电泳法证明能使蛋白质发生盐析的纯度 在一种pH下电泳说明该能使蛋白质发生盐析是纯的,这是不够充 分的应该取两种pH缓冲液,它们分布在能使蛋白质发生盐析等 电点的两侧在这两种pH下电泳都证明此能使蛋白质发生盐析是 纯的,这样財可靠 应该指出,只用一种方法鉴定能使蛋白质发生盐析纯度是不够 的至少应该用两种以上的方法,而且是两种不同 的分离机理的方法来判断能使蛋白质发生盐析纯度才比较可靠 因为常常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的,而在 离子色谱中却分辨为两个组分反之亦嘫。 又如一种样品用凝胶过滤法和SDS—PA

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