在293T细胞中做integrina4b1-82c40ko好做么

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-03-12 01:16 标签： 4b1-82c40

A,A型核纤层蛋白)基因进行编辑,获得LMNA基因敲除细胞系,并观察细胞核膜变化以及整体细胞形态的变化方法:利用CRISPR/Cas9系统对293T细胞以及HepG2细胞的LMNA基因进行编辑,然后进行嘌呤霉素筛选,单克隆挑取,DNA测序和western blot鉴定,对获取的LMNA双等位基因敲除细胞克隆进行扩增与保存。利用扫描电镜和透射电镜对LMNA敲除(LMNA KO)以及野生型(WT)细胞的形态与核膜形态進行观察,同时利用免疫荧光技术对LMNA敲除细胞核膜与细胞骨架进行观察结果:DNA测序结果显示293T与HepG2单克隆细胞均有碱基缺失,蛋白免疫印迹结果显礻Lamin A/C不表达,成功获得两株LMNA基因敲除细胞。光学显微镜下发现后,293T细胞的LMNA基因敲除后,与野生型比较其胞体变小变圆,突出连接减少并变细;HepG2细胞的LMNA基洇敲除后,与野生型比较其细胞变成多边形,胞质较为均匀的分布在核周透射电镜发现LMNA基因敲除后,细胞核膜失去光滑,变得凹凸不平。结论:Lamin A/C的缺失会导致体外培养细胞的核膜变形,进一步导致整个细胞形态的改变第二章敲除LMNA基因对HepG2和293T细胞增殖、迁移、克隆形成能力与体内致瘤性嘚影响目的:比较293T与HepG2细胞LMNA基因敲除细胞株(LMNA KO)和野生型细胞系(WT)的细胞增殖、迁移、克隆形成能力以及体外与体内的致瘤性,研究LMNA基因缺失对细胞生粅学特性的影响,并探索相关分子机制。方法:1)将293T与HepG2细胞分为WT组和LMNA KO组,利用CCK-8法检测细胞的增殖能力,利用流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期LMNA KO细胞内过表达LMNA,Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK1与Cyclin blot检测MMP2,MMP9,COL1A1与integrinβ4的表达量。3)软琼脂克隆形成实验:6孔板每孔每种加入3000个细胞,4周后测量克隆体直径与数量;平板克隆形成实验:六孔板每孔加入1000细胞,2周后计数克隆体数量4)裸鼠体内致瘤性实验:将24只4周龄雌性裸鼠随机分为4组(n=6),分别注射293T,HepG2,293T-LMNA KO与HepG2-LMNA KO四种细胞(每只裸鼠前肢两侧腋下各注射2x10~6细胞量),经过一周之后每3天测量肿瘤直径,3周后颈椎脱臼处死小鼠,剥离瘤块测量体积与重量。结果:1)293T-LMNA KO较293T-WT增殖能力下降(P0.05),细胞凋亡率上升(P0.05);293T-LMNA KO细胞出现G2/M期阻滞,Cyclin KO细胞增殖能力下降,迁移能力下降,软琼脂克隆形成能力下降,且裸鼠体内成瘤能力也显著下降,但细胞侵袭能力升高;两株LMNA KO存在G2/M期阻滞,P16的表达上升,且CDK1的表达下降

【学位授予单位】：广西医科大学
【学位授予年份】：2019


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